FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Oberflächen lebender Zellen oder S harmlos und schnell mit bioaktiven Konstrukten zu markieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Lösung eines funktionellen Spacers, Lipids oder FSL-Konstrukts hergestellt wird. Anschließend wird ein gleicher Teil der Konstruktlösung mit einem gleichen Teil der Zell- oder VIRs-Lösung vermischt.

Im dritten Schritt wird das Gemisch 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Der letzte Schritt besteht darin, die modifizierten Zellen oder Zellen oder modifizierten VIRs oder VIRs zu waschen und sie experimentell wie üblich zu verwenden. Letztendlich können oberflächenmodifizierte lebende Zellen oder S mit allen routinemäßigen experimentellen Analysemethoden einschließlich Durchflusszytometrie, Mikroskopie und Agglutination sichtbar gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der kovalenten Markierung besteht darin, dass sie schnell, robust, flexibel ist und die Vitalität der modifizierten Zelle oder von Varian nicht beeinträchtigt. Um zunächst die Stammlösung des FSL-Konstrukts herzustellen, geben Sie ein Milliliter Verdünnungsmittel zur Produktflasche, um das trockene FSL-Produkt wieder aufzulösen, wodurch eine Stammlösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter entsteht. Sonizieren Sie das Fläschchen 30 Sekunden lang, portionieren Sie die Stammlösung in sterile Behältnisse zu je 100 Mikroliter und lagern Sie die Behältnisse bei zwei bis acht Grad Celsius bis zu einer Woche lang.

Zur Herstellung von gebrauchsfertigen FSL-Konstrukt-Lösungen für die Insertion unmittelbar vor der Anwendung die Lösung erneut 30 Sekunden lang beschallen, um eventuelle Agglomerate aufzulösen, anschließend das FSL-Konstrukt und den Puffer auf die erforderliche Konzentration verdünnen. Die gebrauchsfertige Lösung zwei bis acht Grad Celsius für bis zu einer Woche lagern, nachdem die Zellen in lipidfreiem Medium oder PBS resuspendiert und zur FSL-Modifikation von ungebundenen Lipiden befreit wurden. Danach die Zellen in 100 Mikroliter Verdünnungspuffer aufnehmen, die Zellen für die Kontrollen unter denselben Bedingungen waschen und in 100 Mikroliter unmodifizierter Zellen vorlegen.

Gegebenenfalls 100 Mikroliter einer geeigneten Verdünnung der FSL-Lösung hinzufügen. Parallel dazu negative Kontrollen mit irrelevanten FSL-Lösungen und/oder PBS erstellen. Anschließend alle Zellsubpopulationen eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Waschen Sie alle Zellen zweimal mit fettfreiem Medium oder PBS, um freie FSL-Konstrukte zu entfernen, und stellen Sie eine geeignete Suspension in fettfreiem Medium her. Sobald der FSL-Modifizierungsprozess abgeschlossen ist, können die Coys wie eine Blume bei vier bis acht Grad Celsius gelagert werden. FSL-Konstrukte bestehen aus drei Hauptkomponenten: dem funktionellen Kopf oder F, der eine Vielzahl biologisch funktionaler Gruppen sein kann.

Der Abstandshalter RS wurde entwickelt, um einen Abstand des funktionellen Kopfes von der Membran zu erzeugen, um die Wasserdispergierbarkeit zu verbessern, und ist nicht reaktiv mit menschlichem Serum sowie mit dem DAL-Lipid oder L, wodurch der Konstrukt spontan in Oberflächen vier eingebaut werden kann. Repräsentative FSL-Gruppen sind in den folgenden fünf Abbildungen dargestellt. Lebende murine Embryonen wurden direkt mit FSL-Fluorescein über zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in serumfreiem Zellkulturmedium markiert, gewaschen und anschließend mittels Fluoreszenzmikroskopie betrachtet.

In diesem ersten Bild ist ein zop palita-freies Zweizell-Embryo mit Spiegelung zu sehen. Die intensive Färbung in der Mitte des Embryos ist charakteristisch für eine klassische Polkörper-Färbung. In den nächsten beiden Bildern werden zop palita-freie Vierzell- und Achtzell-Embryonen mit Spiegelung gezeigt, bei denen die Zellen, die außerhalb der Fokusebene des Mikroskops liegen, eine verschwommene Färbung aufweisen.

Ein Bild eines zop palita freien 16-Zell-Mirroring-Embryos ist in diesem letzten Bild von FSL-Fluorescein-markierten lebenden Mirroring-Embryonen zu sehen, vier bis fünf Tage alten intakten Mirroring-Blastozysten-Embryonen, bei denen sowohl der Embryo als auch zop LUCITA markiert sind, dargestellt in dieser nächsten Bildserie. Die FSL-Fluorescein-Markierung von Zebrafischen wird gezeigt. Dieses erste Bild zeigt eine Mikroangiographie eines 52 Stunden nach der Befruchtung befindlichen Zebrafischlarven, dem FSL-Fluorescein direkt in den Kreislauf injiziert wurde.

Die Färbung des Zebrafisch-Gefäßsystems kann hier beobachtet werden. FSL-Fluorescein, heterogene Zellen des Zebrafisch-Nierengewebes oder ZK-Zellen wurden ex vivo erzeugt und anschließend in die Zirkulation eines 52 Stunden nach der Befruchtung stehenden Empfänger-Zebrafischs mikroinjiziert. In-vivo-Beobachtungen der ZK-Zellen erfolgten zwei Stunden nach der Injektion durch Abbildung des Gefäßsystems mittels Fluoreszenz- und Zeitraffermikroskopie. Dargestellt ist ein einzelner Videoframe mit großen, langsam bewegten oder unbeweglichen Zellen, die mit orangefarbenen Pfeilen markiert sind, sowie schnell bewegten Zellen, die aufgrund ihrer Bewegung unscharf erscheinen und mit grünen Pfeilen gekennzeichnet sind. Auf diesem Bild ist die FSL-Fluorescein-Markierung durch orale Aufnahme des Konstrukts zu sehen, die erreicht wurde, indem Zebrafisch-Embryonen bis zu fünf Tage lang in ein Medium mit FSL-Fluorescein eingetaucht wurden.

Die Hellfeldmikroskopie des links gezeigten mit FSL-Fluorescein behandelten Zebrafisches entspricht dem benachbarten Fluoreszenzbild rechts. Die Fluoreszenz war vorzugsweise im Darmtrakt lokalisiert. Bei den hier gezeigten unbehandelten Kontrollembryonen wurde keine Anfärbung beobachtet.

Hier wird gezeigt, dass Vesikuläres Stomatitis-Virus oder VSV direkt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter FSL-Fluorescein für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius markiert, anschließend mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann mittels FACS-Analyse untersucht wurde, ohne dass eine Reinigung des VSV-Virions erforderlich war. Nach der FSL-Markierung war keine weitere Reinigung notwendig. Dieses Histogramm zeigt Schweinetesticularzellen, die mit dem menschlichen A/Puerto Rico/8/1934- oder H1N1-Virus infiziert und mit FSL-Fluorescein markiert wurden.

Nicht fluoreszierende, nicht infizierte Zellen werden durch die schwarze Linie dargestellt, während die Fusion des H1N1-Coron mit den Schweinezellen, die zu Fluoreszenz führte, durch die rote Linie angezeigt wird. In dieser nächsten Bildserie wurden die Zellen zunächst eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit FSL-Biotin markiert, anschließend gewaschen und mit fluorviermarkiertem Avadon umgesetzt, erneut gewaschen und für die Fluoreszenzmikroskopie nass eingedeckt. Das erste Bild zeigt ein zusammengesetztes konfokales Bild von murinen Embryoblasten assist, und diese Abbildung zeigt einen zentralen konfokalen Schnitt des Embryos aus dem vorhergehenden Bild.

Hier sind lebende, bewegliche humane Spermatozoen. Die Unschärfe entsteht als Folge ihrer Bewegung. Ein deutlicheres repräsentatives Bild von humanen Spermatozoen, die nach der Einbringung in 4 % Paraformaldehyd fixiert wurden, ist in dieser Abbildung hier zu sehen.

Mit FSL-Biotin markierte humane Erythrozyten zeigen, dass die Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd die FSL-Markierung nicht beeinträchtigt, wie in den folgenden beiden Abbildungen veranschaulicht. Hier sind 4 % Parmaldehyd-fixierte RL-95-Endometriumkarzinomzellen des Menschen zu sehen. Hingegen sind in diesem Bild die RL-95-Endometriumkarzinomzellen des Menschen nicht fixiert. Zwischen den beiden Aufnahmen mit und ohne Fixierung werden praktisch keine Unterschiede in der Markierung beobachtet.

FSL-Biotin-markierte Erythrozyten, die in einer Blutprobe zwei Stunden nach intravenöser Infusion der Zellen beobachtet wurden, sind hier links dargestellt; die Zellen wurden rechts unter Lichtmikroskopie betrachtet, und dasselbe Zellfeld wurde unter Fluoreszenz untersucht, wobei die beiden vorhandenen Zellen grün identifiziert werden können. Die Berechnung des Verhältnisses der Zellen zu nicht markierten Zellen kann als Indikator für das Überleben dienen. Dieses letzte Bild von FSL-Biotin-markierten Zellen zeigt lebende humane endometriale Biotin-Zellen, die durch Bindung an abgeschwächte Kügelchen sichtbar gemacht wurden.

Diese letzte Bildserie zeigt die Wechselwirkungen von FSL-Konstrukten mit Blutgruppenmarkern. Das erste Bild zeigt humane rote Blutkörperchen (GLI-Zellen), die mit einer Konzentration von 500 Mikrogramm pro Milliliter FSLG beschichtet und gegen Verdünnungen von menschlichem Serum getestet wurden. Humane rote Blutkörperchen reagieren von Natur aus nicht mit dem Xena-Antigen GALI-Antigen.

Daher können Cytes zur Quantifizierung von Antikörperspiegeln im Serum verwendet werden. In diesem Beispiel wurde bei dem Patienten durch Erzeugung von Cytes mit abnehmenden FSL-Konzentrationen ein Antiga-Titer von 1:32 ermittelt. Ähnlich wie bei der Bestimmung eines Antigen-Titers kann ein optimaler Antigengehalt zur Antikörperdetektion bestimmt werden; anschließend können Cytes hergestellt werden, die nur dann ein positives Ergebnis liefern, wenn der Antikörperspiegel einen bestimmten Titer überschreitet.

Die Menge des FSL-Antigens, die für ein positives Ergebnis erforderlich ist, hängt von der Qualität und Konzentration des nachzuweisenden Antikörpers ab. Typischerweise führt bei Kohlenhydratantigenen eine FSL-Lösung mit 100 Mikrogramm pro Milliliter zu einer stark positiven Reaktion. Menschliche rote Blutkörperchen der Gruppe O, die so modifiziert wurden, dass sie eine bestimmte Menge eines Antigens aufweisen, werden als sogenannte standardisierte Präparate bezeichnet.

A-Zellen werden verwendet, um Anti-A-Antikörper in menschlichem Serum genau und reproduzierbar zu quantifizieren. In diesem Beispiel wurden die Zellen aus den eigenen roten Blutkörperchen des Spenders hergestellt, und die Anti-A-Konzentration im getesteten Gruppe-O-Serum betrug 1:32. In der sechsten Röhre wurden hier gezeigt A- und B-Antigene gleichzeitig in eine einzelne Probe von roten Blutkörperchen der Gruppe O eingefügt, um schwache A-, schwache B-Zellen zu erzeugen.

Diese Zellen können für Qualitätskontrollzwecke bei der VO verwendet werden. Die Analyse der speziell formulierten Zellen der Woche A und der Woche B, die mit Anti-A- und Anti-B-Reagenzien getestet wurden, ergibt die erwarteten schwachen Reaktionen, wie in dieser Abbildung dargestellt, wobei die Reaktionen im mittleren unteren Bereich der Röhrchen auftreten. Diese einfache Technik kann innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.