Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine In-vivo-Technik zur Abbildung subzellulärer Dynamiken in C. elegans-Embryonen, die unter Verwendung einer Gasdurchflussanordnung an einem leistungsstarken Mikroskop einer Anoxie ausgesetzt sind, zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Probe junger transgener Adulttiere vorbereitet wird, um eine geeignete Population junger Embryonen für die Bildgebung zu erhalten. Anschließend bereiten Sie dünne Agaros-Pad-Objektträger zur Verwendung in der mikroskopischen Inkubationskammer vor.

Dann werden die Seeschwäne ordnungsgemäß anästhesiert und mit Halocarbon-Öl bedeckt, um Austrocknung während der Exposition gegenüber dem Gasstrom zu vermeiden. Schließlich wird das runde Deckglas mit den anästhesierten Tieren in die Mikro-Inkubationskammer eingebracht. Die Kammer wird anschließend auf den Mikroskopständer gestellt und mit Stickstoffgas gefüllt, um während der Bildgebung eine anoxische Umgebung zu erzeugen, wobei letztendlich ein Gasstrom durch die Mikro-Inkubationskammer geleitet wird.

In Verbindung mit In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder der Zellzyklusarrestierung als Reaktion auf Anoxie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie indirekter Immunfluoreszenz besteht darin, dass subzelluläre Veränderungen in vivo dokumentiert werden können, während die Tiere bestimmten Bedingungen ausgesetzt sind. Obwohl diese Methode Einblicke in die durch Anoxie induzierte Suspended Animation in elegans-Embryonen liefern kann.

Es kann auch auf andere Systeme wie Hefe, Zellkulturen oder andere kleine wirbellose oder wirbeltragende Embryonen angewendet werden. Zusätzliche Bedingungen wie Hyperoxie, Temperatur, Stress oder die Behandlung mit kleinen Molekülen können ebenfalls angewendet werden. Anastacia Garcia und Mary Latt, zwei Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren dieses Verfahren. Beginnen Sie mit einem geeigneten transgenen C. elegans-Stamm der gewünschten Art; in dieser Studie wird der transgene Stamm TH32 verwendet, um Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung sichtbar zu machen.

Erzeugen Sie eine synchronisierte Population, indem Sie erwachsene Exemplare durch Behandlung mit einer Hypochloritlösung aufbrechen, und verwenden Sie die verbleibenden Embryonen, indem Sie erwachsene Tiere auf eine beimpfte Platte überführen und Eier für eine bis zwei Stunden ablegen lassen, oder indem Sie L4-Larven aus einer gemischten Population auf eine neue beimpfte Platte übertragen. Kultivieren Sie die Nematoden bei 20 °C bis zum jungen Erwachsenenstadium (GR), was ungefähr 96 Stunden nach dem Schlüpfen, 72 Stunden nach dem L1-Stadium oder 24 Stunden nach der Häutung zum L4-Stadium benötigt. Diese Methodik ermöglicht die Erzeugung einer Population junger erwachsener Tiere, die eine hohe Anzahl junger Embryonen enthalten, in denen sich große Blastomeren und Kerne befinden, die sich optimal für die Abbildung subzellulärer und subnukleärer Veränderungen eignen.

Um eine feuchte Kammer für die vorbereiteten Objektträger einzurichten, legen Sie ein feuchtes Papiertuch in eine große Petrischale oder einen Behälter, der mit einem Deckel ausreichender Größe abgedeckt ist. Bereiten Sie geschmolzenes 2% Aros in entionisiertem Wasser vor, indem Sie die Mischung in Glaswaren mithilfe einer Mikrowelle oder eines Wasserbades erhitzen. Geben Sie anschließend ein bis drei Tropfen warmes Aros auf einen sauberen Glas-Objektträger, setzen Sie sofort einen zweiten Objektträger umgekehrt senkrecht auf die Aros-Tropfen und drücken Sie leicht darauf, sodass das resultierende Polster dünn und frei von Luftblasen wird.

Nachdem sich das Aros langsam abgekühlt hat, nehmen Sie die beiden Objektträger auseinander, wobei das Aros-Pad auf einem der Objektträger intakt bleibt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Aros-Pad dünn genug ist, um die Fokussierung des Mikroskops nicht zu beeinträchtigen. Verwenden Sie anschließend eine saubere Rasierklinge, um das Aros-Pad zu einem kleinen quadratischen Vorrat zuzuschneiden.

Die Objektträger bis zur Verwendung in der vorbereiteten feuchten Kammer aufbewahren. Mit demselben sauberen Rasierklingenblatt vorsichtig die Kante des Aros-Pads ergreifen und es vom Objektträger auf ein rundes 25-Millimeter-Mikrodeckglas übertragen. Dabei sollte vermieden werden, dass Luftblasen unter dem runden Deckglas entstehen; es muss passend in den Mikroinkubator passen.

Geben Sie einen Tropfen Anästhetikum auf das Aros-Pad. Wählen Sie fünf bis zehn Würmer aus und legen Sie sie in den Tropfen mit Anästhetikum. Warten Sie ein bis drei Minuten, bis die Würmer ihre Bewegung eingestellt haben.

Mit einer Pipettenspitze einen Tropfen Hohlkohlenstofföl auf die Würmer geben, um eine Austrocknung der Würmer zu verhindern, während Gas durch die Kammer strömt. Anschließend ein Ende des flexiblen Kunststoffschlauchs mit der Kammer verbinden. Die beiden Hälften des geschlossenen Perfusions-Mikroinkubators trennen und die Deckglasplatte vorsichtig senkrecht auf den unteren Ring setzen.

Schließen Sie die beiden Seiten der Kammer fest zusammen. Verbinden Sie anschließend die Kammer über den flexiblen Kunststoffschlauch mit dem Stickstoffgasbehälter und platzieren Sie sie auf dem Mikroskoptisch. Überprüfen Sie auf eventuelle Lecks, indem Sie sicherstellen, dass der Schlauch und die Verschlussstopfen an der Seite der Kammer fest angebracht sind, um Embryonen abzubilden.

Zuerst die Tiere bei niedrigerer Vergrößerung lokalisieren. Danach zur geeigneten höheren Vergrößerung wechseln. Um embryonale Blasphemer in erwachsenen Organismen abzubilden, den 488 Nanometer Laser verwenden, um das GFP-Fusionsprotein in den Zellen von Interesse zu lokalisieren.

Um einen bestimmten Stadium des Zellzyklusarrests, beispielsweise die späte Prophase, zu visualisieren, identifizieren Sie einen Blasphemier in einem vorherigen Stadium der Zellteilung, wie der späten Interphase oder der frühen Prophase. Spülen Sie die Kammer mit Stickstoffgas und überwachen Sie weiterhin die Blasphemier, während die Kammer mit Stickstoff gefüllt wird, wobei Sie die Fokusebene bei Bedarf anpassen. Führen Sie eine Zeitrafferaufnahme durch, um das gewünschte Phänomen von Interesse in diesem Fall zu erfassen.

Prophase-Arrest und Andocken der Chromosomen an die innere nukleare Membran. Nehmen Sie alle 10 Sekunden ein Bild auf, bis zu 30 Minuten lang. Typischerweise tritt ein durch Anoxie induzierter Prophase-Arrest innerhalb von 20 bis 30 Minuten nach Beginn des Stickstoffgasflusses auf.

Um die Erholung aus dem durch Anoxie induzierten Arrestzustand zu dokumentieren, schalten Sie das Gas aus und lassen Sie die Kammer unter Aufzeichnung einer Zeitrafferserie in den Normoxiezustand zurückkehren. Die Wiederaufnahme des Zellzyklus und die Rückbildung der Chromosomen erfolgt typischerweise innerhalb von fünf bis zwanzig Minuten. Verwenden Sie ImageJ oder Photoshop, um Bilder und Videos zu bearbeiten, und importieren Sie diese in QuickTime zur Darstellung.

Innerhalb des Embryos, der Anoxie ausgesetzt war, kondensieren die Chromosomen der Prophase. Blasphemers und lagern sich an der inneren nuklearen Peripherie an. Ein Phänomen, das als Chromosomen-Docking bezeichnet wird. Nach der Reoxygenierung setzt die Zellzyklusprogression erneut ein und die Chromosomen der Prophase.

Blasphemie wird sich von der nuklearen Peripherie zur äquatorialen Platte bewegen, was einen Fortschritt in die Metaphase anzeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei bis vier Stunden mit geeignet gestadierten Tieren durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, ausschließlich gesunde, junge erwachsene Tiere zu verwenden, ausreichend Zeit einzuplanen, um das Experiment abzuschließen, und geduldig zu sein, wenn man lernt, geeignet gestadierte Blasphemierer auszuwählen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man anoxieinduzierte subzelluläre Ereignisse in vivo unter Verwendung von GaN-Embryonen und einer Gasdurchflusskammer an einem leistungsstarken Mikroskop aufzeichnen kann.