Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fotoumschaltbare Zellen in einem lebenden Zebrafischembryo zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Embryo eingebettet wird, der ein gewebespezifisches, fotoveränderbares fluoreszierendes Protein in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur exprimiert. Anschließend wird das Protein innerhalb des interessierenden Bereichs vollständig fotochemisch umgewandelt.

Dann wird das Embryo vorsichtig aus dem Agarose entfernt und bis zu späteren Stadien in Ei-Wasser bei 28,5 Grad Celsius kultiviert. Schließlich wird das fotoumgewandelte Embryo erneut in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur eingebettet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass fotoumgewandelte Zellen aufgrund der stabilen Präsenz des fotoumgewandelten Proteins mittels konfokaler Mikroskopie in späteren Stadien präzise detektiert werden können.

Wir sind daher der Ansicht, dass die Methode, die wir heute vorstellen, im Bereich der Zell- und Entwicklungsbiologie sehr nützlich sein wird. Wir gehen davon aus, dass der Einsatz dieser Methodik zur Untersuchung von Zellmigration, Gewebedynamik und anderen zellulären Verhaltensweisen äußerst hilfreich sein wird. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert Veronica Lombardo, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, nachdem transgene Zebrafische, die ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein exprimieren, gekreuzt wurden.

Wählen Sie die hellsten Embryonen aus, die homozygot sind, und züchten Sie sie bei 28,5 Grad Celsius, sobald sie das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie in einem Glasbehälter mit Ei-Wasser zu dechorionieren, um die Embryonen zu anästhesieren. Überführen Sie sie einzeln mit einer Glaspipette oder einer abgeschnittenen Pipettenspitze in Trica.

Überführen Sie ein anesthetisiertes Embryo auf den Deckel einer Kulturschale und halten Sie das Embryo in einem möglichst geringen Mediumvolumen. Überführen Sie das Embryo in Agarose, indem Sie es mit 1 % Low-Melting-Temperatur-Agarose mit Trica bei 30 Grad Celsius anpipettieren, und geben Sie es in eine Kulturschale mit Deckglasboden. Verwenden Sie eine glatte Kunststoffspitze, um das Embryo auszurichten, sobald die Agarose polymerisiert hat.

Decken Sie es mit Trica-Lösung auf einem umgekehrten konfokalen Mikroskop aus, das mit 405, 488 und 561 Nanometer Laserquellen sowie mit einem 20×-Objektiv ausgestattet ist. Nutzen Sie die 488- und 561-Nanometer-Laser, um einen Z-Stack der gesamten Struktur des Präparats, einschließlich des interessierenden Bereichs, aufzunehmen. Wählen Sie das Zeitreihen-Werkzeug und stellen Sie zwei Zyklen ohne Intervall ein, einen für vor und einen für nach der Photo-Umwandlung.

Wählen Sie das Werkzeug für den Bereich aus und definieren Sie einen oder mehrere Bereiche von Interesse für die Fotoumwandlung. Wählen Sie anschließend das Bleichwerkzeug aus und stellen Sie ein, dass die Bleiche nach dem Scan beginnen soll. Einer der beiden hier verwendeten Laser ist ein 30-Milliwatt-405-Nanometer-Diodenlaser.

Sorgfältig optimiert für die minimale Menge an Laserlicht, die für eine vollständige photochemische Umwandlung erforderlich ist, wobei die Intensität des Laserlichts, die Anzahl der Scan-Wiederholungen des interessierenden Bereichs und die Scan-Geschwindigkeit variiert werden. Scannen Sie die Probe mit den 488 Nanometer und 561 Nanometer Lasern, um verbleibende grüne sowie die umgewandelte rote Fluoreszenz des photochemisch umwandelbaren fluoreszierenden Proteins sichtbar zu machen. Nach der photochemischen Umwandlung entsorgen Sie die Lösung und entfernen mithilfe einer Nadel oder einer glatten Kunststoffspritze vorsichtig das Embryo aus dem Agros.

Halten Sie das Embryo in Ei-Wasser im Dunkeln bei 28,5 Grad Celsius bis zum gewünschten Entwicklungsstadium. Betten Sie das Embryo ein zweites Mal ein und erzeugen Sie erneut einen Zack des Präparats, einschließlich der Region von Interesse, unter Verwendung der 488- und 561-Nanometer-Laser. Da dieses Protokoll die normale Entwicklung nicht beeinträchtigt, ist es möglich, das photokonvertierte Embryo in späteren Stadien zu beobachten.

Hier ist ein Beispiel für einen Photo-Konvertierungs-Assay. Endothelzellen wurden während der Zebrafisch-Entwicklung von 48 bis 72 Stunden nach der Befruchtung mithilfe einer transgenen Reportersorte verfolgt, die kick G in endothelialen Kernen exprimiert, wie hier dargestellt. Vor der Photo-Konvertierung wurde kick G im endothelialen Gewebe exprimiert und war nur als grüne Fluoreszenz mittels Kontrollscans mit einem 488-Nanometer-Argonlaser nachweisbar. Mit einem 561-Nanometer-Laser für rote Fluoreszenz wurde vor der Photo-Konvertierung kein photo-konvertiertes kick GR nachgewiesen.

Anschließend wurde der Bereich von Interesse vollständig mit einem 405 Nanometer Diodenlaser bei 10 % Intensität und 20 Iterationen umgewandelt, und die Kopfgefäße wurden erneut mit den 488 Nanometer- und 561 Nanometer-Lasern gescannt. In diesem Panel hatte sich das grüne Signal innerhalb des Bereichs von Interesse vollständig in rotes Signal umgewandelt, um die photoumgewandelten endothelialen Zellen in späteren Stadien verfolgen zu können. Der Embryo wurde 24 Stunden nach der Photoumwandlung beobachtet, was etwa 72 Stunden nach der Befruchtung entspricht, in endothelialen Geweben, die aus dem photoumgewandelten Bereich von Interesse hervorgehen.

Sowohl nicht umgewandelte als auch photoumgewandelte Kick-G-Proteine wurden aufgrund der Stabilität des roten fluoreszenten, photoumgewandelten Kick-G und der Synthese neuer grüner, nicht umgewandelter Kick-G nach dessen Entwicklung beobachtet. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Entwicklungsbiologie, um die Zellbiologie und das Umbauprozess von Geweben bei mehreren Fischarten zu untersuchen.