Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

L'objectif général de cette procédure est de préparer des synaptosomes activement traduits à partir du cortex cérébral de souris, en utilisant un gradient de densité de saccharose discontinu. Ceci est réalisé en premier lieu en collectant et en homogénéisant les cortices de souris, puis en centrifugeant l'homogénat. Ensuite, appliquer l'homogénat centrifugé, ou surnageant, sur les gradients de saccharose préparés.

La dernière étape consiste à centrifuger et à recueillir la fraction de synaptosomes. En fin de compte, les analyses par immunoblot et les expériences d'incorporation de méthionine S 35 montrent que la fraction de synaptosomes est enrichie au niveau synaptique et active sur le plan traductionnel. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la centrifugation et la filtration sont que, premièrement, les dommages mécaniques sont évités grâce à l'utilisation de gradients de densité, et deuxièmement, la toxicité est faible pour les cellules et leurs constituants.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés avec ce protocole, car le chronométrage joue un rôle clé. Une fois les cortis prélevés, la procédure doit être réalisée rapidement. Pour commencer, préparez les couches de gradient à 3, 10, 15 et 23 % en ajoutant les quantités respectives de SIP, comme indiqué dans le manuscrit associé, au tampon GM et mélangez soigneusement.

Préparez des couches en gradient en pipetant deux millilitres de chacune des solutions isosmotiques de Percoll à 23, 15, 10 et 3 % dans des tubes de centrifugation Beckman avec bouchons. À l’aide d’une pipette P1000, l’interface entre les couches doit être clairement visible, sans mélange des couches. Conservez les gradients à quatre degrés Celsius pendant au moins 20 minutes avant utilisation.

Avant de commencer cette procédure, préparez les autres solutions nécessaires comme décrit dans le manuscrit associé. Euthanasiez la souris à l’âge de P13 à P21 et préparez-la pour la dissection en vaporisant de l’éthanol à 70 % sur la nuque et la tête. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pointus pour sectionner la moelle épinière à la base du crâne.

Ensuite, retirez la peau située au sommet du crâne. Incisez le crâne latéralement entre l'os pariétal et l'os interpariétal, ou entre les régions du cerveau et du cortex. Puis, incisez le crâne depuis la base jusqu'au nez en suivant la suture sagittale.

À cette étape, retirez soigneusement l'os pariétal tendre en tirant chaque hémisphère sur le côté. Ensuite, insérez la spatule dans le cerveau au-dessus du cervelet afin de prélever le cortex. Placez-le dans du tampon GM glacé et répétez à nouveau les procédures pour collecter davantage de cortices.

À présent, rincez les corticaux dans du tampon GM glacé. Ensuite, transférez deux corticaux dans un homogénéisateur en verre contenant cinq millilitres de tampon GM froid. Homogénéisez délicatement les corticaux avec cinq à dix mouvements du pilon A, le pilon lâche, suivis de cinq à dix mouvements du pilon B, le pilon ajusté.

Le nombre de mouvements varie selon l'homogénéisateur utilisé. Transférez l'homogénat dans un tube conique de 15 millilitres. Faites-le centrifuger à 1000 ×g.

Centrifuger pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse Allegra six KR afin de former un culot contenant les débris cellulaires et les noyaux. Déposer délicatement deux millilitres du surnageant pour chaque gradient de saccharose, en utilisant un gradient par cortex entier, puis boucher les tubes. Ensuite, centrifuger les échantillons dans un rotor à angle fixe à 32 500 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse Beckman J 2 21.

Une fois terminé, en utilisant des embouts adaptés, le gradient doit présenter une bande SN bien définie ; prélevez et jetez la solution située au-dessus de la bande SN. À l’aide d’une pipette en verre, prélève la bande SN à l’interface 15-23 % ; un gradient donne généralement environ 0,9 à 1,1 millilitre de SNs. Ensuite, transférez-la dans un tube conique et conservez-la sur de la glace.

Ensuite, ajustez la concentration en sel du SNS en ajoutant un dixième de volume de tampon de stimulation 10 fois concentré. Éventuellement, ajoutez du chlorure de calcium 1000 fois concentré afin d'obtenir une concentration finale de 12 ano molaire. Puis, ajoutez le stock de TTX à 1 millimolaire pour obtenir une concentration finale de 1 micromolaire, afin de supprimer l'excitation non spécifique.

L'étape suivante consiste à utiliser le SNS dans l'application en aval appropriée, comme les études sur la traduction des protéines. Pour d'autres applications, le lysat de SN peut être purifié ou concentré à l'aide du kit de préparation d'échantillons Pierce SDS page. La concentration en protéines du SNS peut être déterminée à l'aide du kit d'analyse des protéines micro BCA.

Voici un exemple de six bandes ou fractions. Lorsque le cortex de souris a été homogénéisé et séparé sur des gradients de saccharose au pérol discontinus, les SNS enrichis se trouvaient dans la bande cinq à l'interface 23 à 15 % ; cette bande a été prélevée et examinée par microscopie électronique. Un exemple de vésicules synaptiques intactes et de préservation des éléments pré-synaptiques et post-synaptiques est montré ici sur le immunotransfert.

Une augmentation des marqueurs synaptiques et une diminution des impuretés dans la bande SN d'un gradient de saccharose discontinu permettent de confirmer que l'augmentation de l'incorporation de méthionine S 35 après ajout de glutamate est due à une synthèse protéique de novo. Un inhibiteur de la synthèse protéique, l'anesa mycin à 40 micromolaire, a été ajouté. Cette figure montre la diminution marquée de l'incorporation de méthionine S 35 en présence d'anso mycin, avec ou sans glutamate, par rapport aux niveaux basaux.

Ainsi, les gradients discontinus de saccharose au peral produisent rapidement des SNS très actifs et relativement purs, pouvant être utilisés pour étudier la traduction des protéines. Cette figure montre que la bande cinq du gradient discontinu de saccharose au per core contient les niveaux les plus élevés de synthèse protéique *de novo*. Les SNS préparés en faisant passer un homogénat de cortex à travers une série de filtres à taille de pore décroissante, puis en centrifugeant sur un gradient discontinu de saccharose au per core à des fins de comparaison, contiennent davantage de membranes rompues et moins de SNS intacts que les SNS préparés selon la méthode du gradient discontinu de saccharose au perol. Les SNS préparés selon la méthode du gradient discontinu de saccharose au peral présentent une activité de synthèse protéique *de novo* plus élevée que les SNS préparés selon la méthode de filtration.

Les SNS préparées à partir de souris plus jeunes présentent une activité traductionnelle plus élevée que celles provenant de souris âgées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler les neurozones synaptiques activement traduites en homogénéisant les cortices de souris, en centrifugeant l'homogénat dans un rotor à godets tournants, en centrifugeant le surnageant sur un gradient de saccharose Percoll dans un rotor à angle fixe, puis en collectant la bande de neurozone synaptique obtenue.