דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

המטרה הכללית של הפרוצדורות הבאות היא להפיק דיסקים מטוהרים. אחת מהם מסוגלת לפלוש לתאי מקבל. שתי שיטות שונות להשגת מטרה זו יודגמו בשיטה הראשונה.

חלבון היתוך של חלבון פלואורסצנטי היוצר-סומות (some) מסוג disc one מבוטא באופן יתר בתאי תורם של נוירובלסטומה אנושית NLF. לאחר מכן, התאים נשטפים ב-PBS, נאספים ומעובדים בליזה ללא שימוש בדטרגנטים. ה-DNA מעוכָל ואזורי agro מטוהרים באמצעות מערכת של מדרג סוכרוז.

למולקולות Agrios שטוהרו בשיטה זו יש יעילות נמוכה של פלישה לתאים. הגישה החלופית היא ביטוי יתר של חומצות האמינו 5 98 עד 7 85 של חלבון recombinant disc one ב-e coli. לאחר מכן מסמנים את מקטע החלבון באמצעות DITE 5 94, מבצעים דיאלזה ומטהרים אותו באמצעות מטריצת NI NTA, המסירה כל צבע שאינו קשור או multimeric disc שנותרו.

לפרגמנטים הנוצרים בשיטה זו יש יעילות פלישה תאית גבוהה להערכת הפלישה לתאי המארח. ניתן להשתמש בדיסק חלבון פלואורסצנטי מנוקה, בריבוזומים או בדיסק רקומביננטי מסומן. הפרגמנטים מדגירים עם תאי המטרה הרלוונטיים.

לאחר מכן מוסיפים Trian blue כדי לכבות את הפלואורסצנציה החוץ-תאית, והפלישה מוצגת באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. עד כה, אגרגציה של חלבונים לא הוכרה כמאפיין של מחלות נפשיות כרוניות כמו סכיזופרניה. במקרים בהם חלבון אחד הוא מועמד להפרעה בסכיזופרניה, יכולת פלישה תאית של אגרגטים חלבוניים היא מאפיין בולט של מחלות קיפול חלבונים.

כאן אנו מראים באמצעות שתי שיטות כי אגרגטים של חלבון disc one הם פולשניים לתאים, ולפיכך הפרעות הקשורות ל-disc one או נוירופתיה של disc one הן הפרעות של קיפול חלבונים. שתי השיטות הן ראשית, ניקוי של disc one ASOS באורך מלא מקווי תאים של נוירובלסטומה, ושנית, ביטוי של פרגמנט מולטימרי של ה-C terminal של disc one ב-e coli, וכן ניקוי וסימון באמצעות צבע פלואורסצנטי.

בעוד שהשיטה הראשונה מובילה רק ליעילות נמוכה של פלישת תאים של כ-0.3% מהתאים הסופחים את המיקרוסומים המטוהרים, מקטע החלבון הרקומביננטי הטהור מדביק עד 20% מהתאים החשופים. השיטות המתוארות כאן צריכות להיות ניתנות להעברה לחלבונים אחרים שבהם הוכחו באופן משכנע היווצרות אקרוסום או הרכבה מולטימרית. בכל אחת מ-10 צלחות בקוטר של 10 סנטימטרים.

זריעה של 1.5 × 10⁶ תאי neuroblastoma ואת תאי LF של בני אדם במצע RPMI 1640 מועשר, וגידול למשך לילה. למחרת, התאים צריכים להגיע ל-70% עד 80% התמלאות (confluency). סמנו חמש צלחות לטרנספקציה עם PC DNA 3.1 MRFP ו-disc 1 אנושי מלא המסומן ב-EGFP, וחמש צלחות לטרנספקציה עם פלסמיד EGFP בלבד. עבור כל צלחת בקוטר 10 ס"מ, ערבבו 15 µg של DNA פלסמידי, 30 µL של met affecting ו-750 µL.

Opti MEM באבוב מיקרו-צנטריפוגה, מערבבים באמצעות פיפוט מעלה ומטה, ומדגירים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, כדי לבצע טרנספקציה לתאים, מוסיפים את תמיסת הריאגנט לטרנספקציית ה-DNA בטיפות לתאים, ומדגירים את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO₂. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, מנטרים את הביטוי של MRFP full length disc one ומאשרים את היווצרות ה-agro zones תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה. חלק מהתאים מכילים הכללות מאסיביות של חלבון פלואורסצנטי, כפי שמוצג כאן.

פרוטוקול זה משלב שיטה לטיהור גופי לוי (Lewy bodies) מרקמת מוח ואת הפרוטוקול לבידוד אגרגטים גדולים יותר או אזורי agro, כיוון ששיטות קיימות מבוססות על שימוש בדטרגנטים, בידוד חלבון נטול דטרגנט ליישום במבחני פלישה תאית הוא קריטי. כעת, שאבו את המדיום, שטפו עם PBS והוסיפו 400 µL של PBS המכיל תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitor cocktail). לאחר מכן, גרדו את התאים והוסיפו 1 mL של תרחיף תאים ו-10 חרוזי קרמיקה לשפופרת ליזיס בנפח 2 mL.

בצע ליזה לתאים באמצעות שלושה פולסים של 62 שניות בהומוגנייזר pre-cell lyse 24. הכוח המכני של התהליך עלול להעלות את הטמפרטורה בתוך הדגימה מעל 37 °C, לכן יש להקפיד על קירור הדגימה על קרח. לאחר הליזה ואחרי קירור התאים על קרח, הוסף 10 mM magnesium chloride ו-40 units/mL DNAA, ודגור למשך 60 דקות ב-37 °C תוך써ניעור.

הכינו 10 מיליליטר של כל אחד מהריכוזים הבאים: 80%, 50% ו-20% סוכרוז (משקל לנפח) ב-PBS. לאחר מכן, בתוך מבחנה קונוית של 15 מיליליטר, הכינו את מדרג הסוכרוז החל משני מיליליטר של 80% סוכרוז, ולאחריהם שני מיליליטר של 50% ושני מיליליטר של 20% סוכרוז. מזגו את המדרג לאט והקפידו לא להפריע לשכבות שכבר נמזגו.

שכבדו את הליזאט שעבר עיכול מעל הגרדיאנט וסובבו בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם עצירת הסיבוב, אספו בזהירות באמצעות פיפטה את הממשק שבין שכבת ה-50% ל-80% סוכרוז, ערבבו עם חמישה נפחים של תמיסה בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר וסובבו בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1000 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסירו בזהירות את עליון הנוזל (supernatant) ושמרו את המשקע המכיל את אזור הגרדיאנט.

חזרו על השטיפה פעמיים נוספות בממשק זה. אזורי ה-Agri הם פלואורסצנטיים וניתן להדמיותם במיקרוסקופ תחת אור UV לאחר השטיפה האחרונה; השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-250 עד 500 µL של PBS. משקע זה מכיל את אזורי ה-agro המזוקקים.

הוסיפו 10 µL של תרחיף MRFP disc one asome לכל באער של פלטת 24 באערים המכילה תאי נוירובלסטומה אנושיים מסוג SHSY five Y, המבטאים באופן קונסטיטוטיבי soluble GFP disc one C terminus על כיסויי זכוכית סטריליים, והדגירו למשך 48 עד 72 שעות. לאחר ההדגרה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS ובצעו כיבוי (quench) של הפלואורסצנציה החוץ-תאית באמצעות 0.04% tripan blue למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שטפו עם PBS כדי להסיר את ה-trian blue. בשלב הבא, הניחו את הצלחת על קרח והוסיפו 4%PFA ו-PBS למשך 10 דקות כדי לקבע את התאים. לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם מים סטריליים והצמידו את כיסויי הזכוכית (cover slips) לשקופיות זכוכית באמצעות תווך קיבוע prolonged gold עם DPI.

יש לאשש את הספיגה בפלישה של aggro zones שהחלו מחוץ לתא, באמצעות קולוקליזציה עם חלבונים שגויסו ובוטאו על ידי התאים המקבלים בתמונות Z-stack. ה-Z-stack כולל עומק של כשישה מיקרומטרים.

24 תמונות שצולמו במרווחים של 200 nanometers. הפלואורסצנציה של אזור ה-agri ב-MRFP disc one המוצג באדום מגייסת את ה-GFPC terminal disc הציטוזולי. פagment אחד המוצג בירוק מראה קולוקליזציה שמופיעה כצהוב ומצביעה על כך שאזורי ה-agri חדרו לציטוזול של המקבל וגייסו חלבון disc one שהיה מסיס בעבר.

בחלק זה של הפרוטוקול, יסומן ה-human disc one באמצעות DITE 5 94. סימון זה מאפשר ניטור ישיר של החלבון הרקומביננטי ללא צורך בצביעה אימונוהיסטוכימית נוספת. התחל בשחרור החלבון, שהוכן כפי שמתואר במסמך המצורף, מ-beam mercaptoethanol על ידי דיאליזה של התמיסה שלוש פעמים בשני ליטרים של PBS בדילול של 1:2000.

בסמוך לסימון, המיסו 1 mg של דיסק 1 עם DITE 5 94 IDE; המיסו חלבון בריכוז של 1 mg/mL ב-PBS והוסיפו 5 mM TCEP לשחזור קבוצות TH חופשיות. הוסיפו 20 µL של צבע המומס ב-DMF לתגובה והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. באמצעות קסטת דיאליזה SLI עם סף משקל מולקולרי של 10,000 Daltons, בצעו דיאליזה לחלבון שלוש פעמים ב-PBS ביחס של 1:2000 למשך שעתיים בכל פעם, כדי להעלות עוד יותר את רמת הטוהר של החלבון המסומן.

מבוצע טיהור זיקה (affinity purification) המבוסס על תג His בעמודת Ni NTA. שוטפים מיליליטר אחד של מטריצת Ni NTA עם 10 מיליליטר PBS, לאחר מכן מעבירים את החלבון המסומן שעבר דיאליזה לעמודה ומניחים לו לזרום דרכה.

התמיסה תאבד לאט את חלק מצבעה הכחול עקב קישור החלבון למטריצת ה-NTA, וצבע חופשי שאינו מסומן יישאר בשטיפה (flow through). לאחר הכנסת תמיסת החלבון לעמודה, שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 20 milliliters PBS. כדי לאלוט את החלבון, הוסיפו לעמודה שני milliliters של PBS המכיל 500 millimolar ole.

כוון את השסתום למהירות איטית ובצע אלוציה בטיפות תוך ניטור של הפס הצבעוני בעמודת ה-Ni-NTA. חלק זה של האלואט, המזוהה לפי צבעו, מכיל חלבון רקומביננטי מסומן. העבר את האלואט לקסית דיאליזה מסוג SLI ובצע דיאליזה של האלואט שלוש פעמים אל מול 10 millimolar NAPI בדילול של 1:2000 למשך שעתיים בכל פעם בשני ליטרים. לאחר הדיאליזה, העבר את האלואט דרך מסנן מזרק סטרילי של 0.45 micrometer, לאחר מכן חלק למנות של חמש דגימות של 100 µL והקפא בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי.

הכמות הכוללת של חלבון צריכה להיות 0.5 עד 1 µg/mL בכל אליקוט של 100 µL. כדי להעריך את יכולת הפלישה של החלבון, יש להוסיף לכל באער של פלטת 24 באערים המכילה תאי נוירובלסטומה אנושיים מסוג SH SY 5Y מקבלים, המבטאים באופן קבוע את תג ה-GFP המסיס ב-C terminus של חלבון disc one על כיסויי זכוכית סטריליים, מצע המכיל 5 עד 10 µg/mL של חלבון recombinant disc one מסומן. יש להדגיר למשך 48 עד 72 שעות.

בצע כיבוי (quench) של פלואורסצנציה חוץ-תאית, קבע והטמע את התאים כפי שבוצע עבור התאים שעובדו באזור ה-agri, ואשר את הפלישה של החלבון הרקומביננטי שהוסף באופן אקסוגני באמצעות Zack Imaging. כאשר החלבון המסומן נקלט, הוא מזוהה בתוך היקף התאים המקבלים בתמונות שהופקו במיקרוסקופיה קונפוקלית. Zack זה כולל עומק של כ-5 µm ב-24 שלבים של 220 nm.

כאן, מקטע רקומביננטי של disc one 5 98 עד 7 85 המוצג באדום נקלט על ידי תאי מקבל המבטאים את ה-C terminal של disc one המסיס המסומן ב-GFP המוצג בירוק, וזאת כדי לקבוע את הפולשנות של אגרגטים של חלבון disc. One agro zones העשויים מ-disc one באורך מלא המסומן ב-MRFP טוהרו מתאי NLF והחלו על תאי SH SY five Y מקבלים כפי שמתואר בתמונה זו, כפי שמוצג כאן. אקרוזום של disc one המסומן ב-A-M-R-F-P פלש לתא נוירובלסטומה אנושי SH SY five Y המבטא C terminal של disc one המסיס המסומן ב-GFP.

יתרה מכך, גלומרומרdisc one asome המסומן ב-MRFP היה מסוגל לגייס disc one מסיס המסומן ב-GFP לתוך אגרגטים בלתי מסיסים. כדי לקבוע את הפולשנות, recombinant disc one המסומן ב-DIA light הוחל על תאי נוירובלסטומה SH SY five Y המבטאים GFP disc one מסיס, כפי שמוצג כאן. חלבון recombinant disc one המולטמרים, המוצג באדום, פלש לתא המקבל; נקודות צהובות מעידות על גיוס של C terminal disc one מסיס המסומן ב-GFP לתוך אגרגטים. recombinant disc one מסומן, שהובטא וטוהר מ-e coli, היה פולשני לתאים גם בנוירונים in vivo כאשר החלבון המולטמרי הוזרק באופן סטריאוטקטי לקליפה הפרה-פרונטלית המדיאלית של חולדה. דימוי Z-stack מאשר את נוכחותו של חלבון recombinant disc one בנוירון קורטיקלי של חולדה שנצבע באמצעות נוגדן נגד גרעינים נוירונליים.

הצגנו בפניכם שתי שיטות ליצירת אגרגטים של disc one לצורך חקר פלישה תאית. באמצעות כל אחת מהשיטות הללו, ניתן לבחון את ההשפעות התאיות של ספיגת אגרגטים של disc one ללא המשתנים המבלבלים הפוטנציאליים של ביטוי גנים רקומביננטיים באמצעות טרנספקציה של DNA זר. ניתן ליישם טכניקות אלו כדי לחקור את ההשפעות הביולוגיות של פתולוגיית חלבון disc one in vitro בתאים, ו-in vivo באמצעות הזרקה תוך-מוחית או דרכי מתנה להגשה אחרות במודלים של בעלי חיים.

אנו סמוכים ובטוחים כי ניתן יהיה להעביר טכניקות אלו גם לצברים של חלבונים אחרים בעתיד, באמצעות שינויים קלים בפרוטוקול שיוסדר עבור כל חלבון ספציפי. בעת ביצוע הליך זה, הקפידו להקדיש זמן לניתוח קפדני של תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית.