השיטה MODS לאבחון שחפת שחפת עמידים multidrug

מכל שלושה אנשים בעולם, אחד נגוע בשחפת. אבחון שחפת פעילה מונע הדבקות חדשות, מכיוון שחולים עם שחפת פעילה ימשיכו להדביק בין 10 ל-15 אנשים אחרים בשנה עד למועד שבו הם יקבלו טיפול או ימותו. Mods הוא ראשי תיבות המשמשים אותנו כדי להימנע מאמירה של microscopic observation, drug susceptibility assay, והסיבה לשם זה תהיה ברורה ככל שהמתודולוגיה תוסבר.

בסרטון הקצר נסקור את מתודולוגיית ה-mods לאבחון מהיר וזול של שחפת ושחפת עמידה לריבוי תרופות. הסרטון יעקוב אחר המתודולוגיה שלב אחר שלב. נדון בהשלכות הבטיחות הביולוגית של עבודה עם תרבית נוזלית, ונסביר גם כמה מסוגיות הבטחת האיכות החשובות הנדרשות לשימוש במתודולוגיה זו.

בדיקת ה-mods פותחה באוניברסיטת Kayana בלימה, פרו, במעבדה של Bob Gilman. הפיתוח התבסס על תצפיות שבוצעו בתחילה על ידי loose cavi. LOOSE ניסה לזהות דרכים מהירות לגילוי mycobacterium tuberculosis בתרביות באמצעות אינדיקטורים קולורימטריים.

אך היא ציינה כי תצפית במיקרוסקופ של תרבויות אלו חשפה צמיחה של מיקרו-בקטריות מספר ימים לפני שהאינדיקטורים הקולורימטריים שינו את צבעם, ועל בסיס תצפית זו פותח הבדיקה של MOD. הבדיקה של MOD פותחה בסביבה עם משאבים מוגבלים ומיועדת לסביבות עם משאבים מוגבלים, ולכן עלותה היא פחות מ-3 לכל בדיקה לזיהוי שחפת (TB) המבוסס על תרבית נוזלית וזיהוי עמידות לרב-תרופות. היא מושכת ביותר ובפעם הראשונה מביאה יכולת אבחונית מסוג זה למקומות שבהם המשאבים מוגבלים.

בדיקת ה-mods מבוססת על שלושה עקרונות מרכזיים. הראשון הוא ש-mycobacterium tuberculosis גדל במצע נוזלי במהירות רבה הרבה יותר מאשר במצע מוצק. זוהי עובדה הידועה כבר שנים רבות.

שנית, אם נבחן את מצעי הנוזל הללו תחת המיקרוסקופ, נוכל לזהות את צמיחת ה-myb tuberculosis הרבה יותר מהר מאשר בהמתנה להופעה מאקרוסקופית של מושבות על מצעים מוצקים. ואכן, צמיחה זו היא מאפיינת לחלוטין, כך שניתן להבדיל בין M tuberculosis במצע נוזלי לבין זיהום חיידקי או פטרייתי, או אף מצמיחה של mycobacteria שאינן tuberculosis שעלולות להיות נוכחות. לבסוף, וזהו אולי החלק המרגש ביותר בבדיקת ה-mods, הוא שניתן לשלב את התרופות, כגון rifampicin, ובכך לזהות עמידות למספר תרופות ישירות מדגימה של ליחה.

באמצעות שימוש בתרופות אלו בתחילת הבדיקה, נוכל לזהות הן שחפת והן האם הבידוד עמיד לשתי התרופות הללו בו-זמנית. דבר זה מבטל את הצורך בתתי-תרביות וביצוע בדיקת רגישות לתרופות באופן עקיף. כעת נסקור את הציוד הנדרש לביצוע בדיקת ה-mods.

מקרר נדרש לצורך אחסון של מצעים שהוכנו. מאזנה נדרשת לשקילה של ה-is וה-Rifampin. וורטקס נדרש לערבוב של הליחה.

בעבודה עם תמיססת הדאקונטמינציה, נדרש צנטריפוגה לריכוז דגימת הליחה שעברה דאקונטמינציה, אשר תהיה מסוגלת להגיע ל-3000 G. הצנטריפוגה אינה חייבת להיות מקוררת, אך חיוני שיהיה היא בטוחה ביולוגית (bios safe). עבור עבודה עם מיקובקטריום, נדרש שדליי הצנטריפוגה יהיו ניתנים לאטימה באמצעות מכסים ננעלים. נדרש אינקובטור המסוגל להגיע ל-37 מעלות צלזיוס ולשמר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

אין צורך בהעשרה ב-CO2. נדרש מיקרוסקופ הפוך לקריאת צלחות המודס (mods), וזה צריך לכלול עדשות אובייקטיביות של 4x ו-10x. נדרש אוטוקלאב לעיקור מצעים וכן לפינוי תרביות מיקרו-בקטריאליות; נדרשים מיקרו-פיפטות למדוד מנות (aliquot) למצעים, וקבינה לבטיחות ביולוגית מדגם Class two נדרשת להליכים הכוללים טיפול בדגימות ליחה והזרעה של צלחות.

הריאגנטים הדרושים לביצוע בדיקת ה-mods הם כדלקמן: מצע Middlebrook seven H nine, קסון וגליצרול, Panta, שהוא תוסף האנטיביוטיקה, ו-OADC, תוסף התזונה. מלאים של אנטיביוטיקה הכוללים Rifampin, dimethyl sulfoxide (DMSO) להכנת rifampicin, sodium hydroxide, sodium citrate ו-nyl cysteine לדה-קונטמינציה של ליחה, di sodium phosphate ו-mono potassium phosphate להכנת באפר פוספט, sodium hypochlorite בריכוז 10% להשמדת פסולת מזוהמת וחומר חיטוי לניקוי משטחי עבודה. הפלסטיקה והחומרים המתכלים הבאים דרושים גם הם: מבחנות זכוכית סטריליות, מסננים של 0.2 µm לממסים מימי ומסננים של 0.2 µm לממסים אורגניים, מבחנות מיקרו-צנטריפוגה, מבחנות צנטריפוגה של 15 ml, פיפטות סרולוגיות סטריליות של 50 ml ו-10 ml, טיפים סטריליים למיקרו-פיפטה, פלטות של 24 בארות מסוג tissue culture ושקיות Ziploc הניתנות לסגירה, שבהן מניחים את פלטות 24 הבארות לאחרe接 inoculation של דגימת הליחה אל המצע.

ישנן ארבע קבוצות של תמיסות סטוק שניתן להכין מראש. תמיסת בופר הפוספט מורכבת משילוב של תמיסות נתרן פוספט דיבסי ואשלגן פוספט מונובסי המותאמות ל-pH של 6.8 פלוס או מינוס 0.2. תמיסה זו עוברת עיקור באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 עד 124 °C למשך 15 דקות, ואליקוט ממנה מזורע על אגר מזינו (nutrient agar) כדי לאשר את הסטריליות.

ניתן לאחסן זאת במקרר בטמפרטורה של 2°C עד 8°C למשך עד חודש אחד. כל דגימת ליחה דורשת 10 mL של תמיסת בופר פוספט. תמיסת המקור לדיקונטמינציה של ליחה היא שילוב של נתרן הידרוקסיד ונתרן ציטראט.

מערבבים תמיסות אלו בנפחים שווים ומעקרים באוטוקלבה בטמפרטורה של 121 עד 124 °C למשך 15 דקות; ניתן להסמיק אותן במקרר בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך עד חודש אחד. נדרשים 2 mL מתמיסה זו עבור כל דגימת ליחה. מצע התרבית הבסיסי מורכב מ-Middlebrook 7H9 עם קסאון (cascione) וגליקרול.

את אבקת ה-seven H nine ממיסים במים מזוקקים סטריליים המכילים גליצרין וקסקאון, ומערבבים תחת ערבוב קבוע עד להמסה מלאה. את המצע מעקירים באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 עד 124 °C למשך 15 דקות, ולאחר קירור מחלקים אותו למנות של 4.5 ml בתוך מבחנות זכוכית סטריליות בגודל 16 by 100 mm. את המצע מדגירים בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות כדי לוודא סטריליות, דבר שבא לידי ביטוי בהיעדר עכירות לאחר פרק זמן זה, וניתן לאחסנו בטמפרטורה של 2 עד 8 °C כאשר הפקק סגור היטב למשך עד חודש אחד.

כל דגימת ליחה דורשת מבחנה אחת המכילה 4.5 milliliters של תרבית זו. תמיסות מלאי של אנטיביוטיקה למצע מוכנות באופן הבא: המסה מלאה במים מזוקקים סטריליים וסינון באמצעות מסנן מזרק של 0.2 micrometer עבור ממסים מימיים. ניתן לאחסן מנות של 20 microliter במבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות בטמפרטורה של minus 20 degrees centigrade למשך עד שישה חודשים; כל מנה של 20 microliter מספיקה לעד מאה דגימות.

מכינים תמיסות סטוק של Rifampin בריכוז של 8 mg/ml על ידי המסת rifampicin ב-DMSO ובמים מזוקקים סטריליים. תערובת זו מסוננת באמצעות מסנן מזרק של 0.2 µm לממסים אורגניים, ואת התמיסה ניתן לשמור באליקוטים של 20 µL במבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות בטמפרטורה של 20°C- למשך עד שישה חודשים; כל אליקוט של 20 µL מספיק לעד 100 דגימות. כעת נעבור לחלק של המתודולוגיה עצמה ולשלושת השלבים שיש לבצע ביום הפרוצדורה.

בשלב זה נמיר את תמיסות המלאי לתמיסות עבודה. ראשית נכין את תמיסת הדה-קונטמינציה, לאחר מכן את תמיסת המצע, ולבסוף את תמיסות העבודה של התרופות isen ו-Rifampin.

שיטת דה-קונטמינציה, המשמשת עבור מתודולוגיית ה-mods, היא מתודולוגיית דה-קונטמינציה סטנדרטית של sodium hydroxide ו-nalk. ה-nalk הוא חומר ממיק ליחה (mucolytic), המסייע בפירוק הליחה ומאפשר ל-sodium hydroxide לבצע את הדה-קונטמינציה. לשם כך, נדרש תמיסת סטוק של sodium hydroxide sodium citrate, ומוסיפים 0.1 grams של NA ל-20 mls של תמיסה זו.

יש להשליך כל תמיסה שלא נעשה בה שימוש ביום הכנתה. יש לבצע את ההכנה הסופית של תוצר התרבית אף היא רק ביום השימוש. בתווך המאגור של seven H nine, מערבבים OADC ו-panta; בכל מבחנה מערבבים 4.5 milliliters של התווך עם 0.5 milliliters של OADC ו-0.1 milliliters של Panta.

כמות זו מספיקה לדגימה אחת. תמיסות עבודה של כל תרופה מוכנות ביום השימוש, ויש להשליך כל תמיסה שלא נעשה בה שימוש כיוון שלא ניתן להבטיח את פעילותה. אליקוטים מאוחסנים מדוללים באופן סדרתי בלוחות תרבית רקמה של 24 בארות עם מצע 7H9 OADC, כך שהריכוז הסופי בבאר המושג לאחר הוספת דגימת הליחה עם המצע הוא 0.4 µg/mL עבור foric acid ו-1 µg/mL עבור Rifampin.

נעבור כעת להליך הדה-קונטמינציה (ניקוי זיהומים), שני מיליליטר של דגימת ליחה מוכנסים למבחנה מסוג Falcon בעלת בסיס קוני, ולאחר מכן מתווספים שני מיליליטר של תמיסת הדה-קונטמינציה של סודיום הידרוקסיד. המכסה מוחזר ומסובב היטב, ולאחר מכן התססוף עובר ערבוב ב-vortex ומושאר למשך 15 דקות, זמן שבו מתבצע תהליך הדה-קונטמינציה. לאחר זמן זה, מתווספים 14 מיליליטר של תמיסת בופר פוספט.

הכיסוי מוחזר ומסוובב עד להיסגירה הדוקה, והמבחנה מוכנסת לצנטריפוגה. לאחר 50 דקות ב-3000 G, הש supernat S נשפך והמשקע שנותר הוא הדגימה שברצוננו לזרוע באמצעות מבחנות של 5.1 מיליליטר של 7H9 OEDC panter. המשקע שלנו מושעה מחדש לנפח של כ-שני מיליליטר. מחצית מדגימה זו, לאחר השעיה מחדש, נשמרת כגיבוי במבחנת מיקרו-צנטריפוגה.

דגימה זו תהיה זמינה במקרה שהתרבית שלנו תהיה מזוהמת ונצטרך לזרע את הדגימה שוב. המיליליטר השני מתווסף לשבעת ה-H9 O A DC Panter הנותרים בתוך מבחורת הזכוכית שלנו, וזוהי הדגימה שמוכנה לזריעה. 900 microliters של תרחיף זה, המורכב ממצע ומהדגימה, מועברים לכל אחת מארבעה בארות בעמודה של פלטת 24 בארות.

את שאר הבארים בלוח ה-24 באערים ממלאים בדגימות עוקבות, כך שחמש דגימות ממלאות לוח של 24 באערים, דגימה אחת לכל אחת מחמש העמודות, והעמודה השישית נשארת ללא דגימה. העמודה השישית משמשת כביקורת שלילית; לעמודה זו מוסיפים את כל מרכיבי המצע ללא דגימת ליחה, וכל צמיחה בעמודה זו מעידה בבירור על בעיה של זיהום צולב (cross contamination), ובמקרה כזה יש להשליך את כל הלוח.

כל מצע שאנו מריצים דורש עמודה של ביקורת שלילית. כעת יש לנו את המצע המכיל את כל הדגימות והמצעים שלנו. עלינו להוסיף את תרחילי האנטיביוטיקה במצע נפרד.

הכנו את הדילולות של Rifampin ו-Isid כפי שתואר בעבר, ובאמצעות פיפט רב-ערוצי בעל ארבעה ערוצים, אספנו 100 µL מכל אחת מבארים אלו וחילקנו 100 µL של 7H9 OADC לכל אחת משתי בארי הביקורת, ו-100 µL של Rifampin ו-100 µL של isid לכל אחת משתי הבארים המכילות את התרופות. לאחר השלמת מילוי הפלטה, המכסה הוחזר למקומו והיא הוכנסה לתוך שקית Ziploc. מרגע זה השקית אינה נפתחת שוב, ולפיכך, לכל תרבית שתגדל במדmeets נוזלי לא תהיה אפשרות לצאת מהשקית.

כל הקריאות של הפיתח מהשלב הזה ואילך מבוצעות בתוך השקית, והשקית מונחת בתוך שקית אוטוקלאב ונזרקת בסיום התרבית. באופן זה, אנו נמנעים ממניפולציה של תרחיפים ריכוזים גבוהים של mycobacteria. נדבר כעת מילה או שתיים על בקרת איכות.

במתודולוגיית ה-mods קיימות בקרות איכות מובנות, החיוניות לשימוש נכון באסיי. ראשית, קיימות בקרות שליליות המורצות בכל פלטה. אלו הוזכרו קודם לכן, אך לסיכום, קיימת עמודה המכילה את כל רכיבי המצע ללא נוכחות של דגימת ליחה, לצד חמש דגימות ליחה אחרות בפלטה; יש לבחון את הבארים בעמודה זו בדיוק כפי שבוחנים כל באר אחר, ונוכחות של כל צמיחה בבארים אלו מעידה על כך שהתרחשה זיהום צולב (cross-contamination) ושלפיכך לא ניתן לסמוך על אף אחת מהתוצאות בפלטה.

לפיכך, יש להשליך את הפלטה ולבצע זריעה מחדש של כל הדגימות. בנוסף, קיימות בקרות פנימיות המשמשות כביקורות חיוביות. אלה מורצות על פלטה נפרדת, ופלטה זו מוכנה לאחר הכנת כל שאר פלטות הדגימות בסוף היום, וזאת כדי למזער את הסיכון לזיהום צולב בתוך המעבדה.

בצלחת נפרדת זו, אנו מריצים זן אחד רגיש לחלוטין של mycobacterium tuberculosis וזן העמיד ל-isid ולריפמפיצין. אם עולים חששות מהרצת זן עמיד למספר תרופות (MDR) על צלחת, ניתן להריץ זן העמיד לריפמפין בלבד וזן העמיד ל-is בלבד במקום שני זנים אלה, הרגיש וה-MDR. מטרתם של זנים אלה היא להדגים לא רק שהמצע תומך בצמיחה, ולכן בכל הבקרות החיוביות שלנו צריכה להיות צמיחה באזור ללא התרופה, אלא גם שריכוזי התרופות שלנו נכונים, ולכן הבקרות החיוביות הרגישות לא צריכות לצמוח בנוכחות is וריפמפין, והבקרות החיוביות העמידות צריכות כמובן לצמוח בריכוזים של ריפמפין ו-is המצויים בצלחת.

כעת נעבור לקריאת הפלטות. אם נתייחס ליום הזריעה של הדגימות שלנו, קריאת הפלטות של יום אפס מתחילה ביום החמישי. לפני כן, צמיחה של mycobacterial נראית לעיתים רחוקות מאוד.

הצלחות נבחנות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. כלומר, הצלחות נבחנות מלמטה למעלה, דבר המאפשר לנו לראות את השרוכים בבירור; ניסיון לדייק את תרביות מהצד העליון מופרע על ידי עיבוי על מכסה הצלחות, וכן מכיוון שאורך המוקד של מיקרוסקופ סטנדרטי אינו מספק. בדיקה מיקרוסקופית מבוצעת בדרך כלל עם עדשה של 10x; תרביות חיוביות נחשבות כאלו שבהן יש לפחות שתי יחידות יוצרות מושבות (colony forming units) בשני הבארים ללא תרופה.

ניתן לזהות בקלות נוכחות של זיהום מכיוון שהתווך הופך לעכור, ועד היום החמישי חלה בדרך כלל צמיחה יתרה ברוב הבאר. בניגוד לכך, צמיחה של מיקובקטריות אינה מובילה לעכירות של הבאר; הצמיחה הראשונית של מיקובקטריות יוצרת צורות קטנות דמויות פסיק, שמתפתחות בהדרגה לצורות אופייניות של חבלים או קשרים. בתוך שבועיים, צמיחה חיובית חזקה תייצר התקברויות של מיקובקטריות, כאשר החבלים יהיו גלויים למעשה רק בקצוות.

רובם המכריע של התרביות שיהפכו לחיוביות יהיו חיוביות עד ליום ה-14, ולפיכך אנו ממליצים על קריאות יומיות מהיום החמישי עד היום ה-14, ולאחר מכן על קריאות כל יומיים או שלושה ימים בהתאם לעומס העבודה במעבדה. ביום שבו תרבית היא חיובית בבירור בשני הבארות ללא התרופות, יש לקרוא את הבארות המכילות תרופה. כל צמיחה בנוכחות של אחת התרופות מעידה על עמידות לאותה תרופה. חשוב מאוד לציין כי אם קריאת הבארות המכילות תרופה מבוצעת יותר משבוע לאחר שהתרבית בבארות ללא התרופות נמצאה חיובית, הדבר עלול לא להעיד על עמידות, שכן לעיתים נצפית צמיחה פריצתית (breakthrough growth).

ניתן להפסיק את הקריאות ביום ה-21 אם תרבית היא שלילית, שכן תרביות חיוביות לאחר זמן זה אינן נצפות מעולם בחולים שאינם מקבלים טיפול. עם השלמת 21 ימי דגירה, ניתן להשליך את התרביות. התרביות נשארות בתוך שקי ה-Ziploc שלהן, מוכנסות לשקי אוטוקלבה ועוברות עיקור באוטוקלבה בטמפרטורה של 121 עד 124 degrees centigrade למשך 45 עד 60 דקות, ולאחר מכן ניתן להשליכן בבטחה. אני רק אומר כעת כמה מילים על בטיחות ביולוגית ועל בדיקת ה-mods, כיוון שהפצנו את ה-mods לא רק בפרו, אלא גם באתרים באפריקה ובאסיה.

שאלה חוזרת עולה בנוגע לאבטחה ולבטיחות הביולוגית של שימוש בתרביות מיקרובקטריות במדיום נוזלי. זהו חשש מובן מכיוון שנוזלים עלולים להישפך, בעוד שמדיומים מוצקים אינם נושאים סיכון זה, וכן קיים סיכון להיווצרות אירוסול כאשר עובדים עם תרחיפים של mycobacteria. למעשה, בגלל סיבות אלו בדיוק אנו מאמינים שמתודולוגיית mod היא מתודולוגיה בטוחה יותר מכל מתודולוגיה הדורשת בדיקת רגישות תרופתית עקיפה.

הסיבה לכך היא שבבדיקת רגישות עקיפה, מכינים תרחיף בריכוז ידוע של מיקרו-בקטריות. פעולה זו כרוכה, לפיכך, בטיפול בתמיסות ריכוז גבוה של מיקרו-בקטריות, עם כל הסיכונים הנלווים של שפיכה ויצירת אירוסולים. לעומת זאת, מתודולוגיית ה-mods, כפי שראיתם כעת, כוללת פשוט את הזרקת דגימת ליחה לתוך המצע שלנו, שלאחריה נסגר המצע בתוך שקית פלסטיק.

שקית זו אינה נפתחת שוב, ולכן איננו צריכים להתמודד עם תמיהות ריכוז גבוה אלו. אין בכך כדי לומר שאנו סבורים ששיטת ה-mod בטוחה לחלוטין; טיפול במייקובקטריה תמיד כרוך בסיכון. עם זאת, נתונים מקוריאה שפורסמו בשנת 2006 נראו כמאששים את עמדתנו לפיה שימוש ב-mods אינו מסוכן יותר מפיזור של כל תרבית אחרת על מצע גידול.

זהו מחקר שנערך בקרב עובדי מעבדה, אשר הראה כי הסיכונים התעסוקתיים לעובדי מעבדה שביצעו זריעה של תרביות ולא היו אחראים לבדיקות רגישות לתרופות לא היו גבוהים יותר מאלו של העובדים המבצעים מיקרוסקופיה של משטח סputum. לעומת זאת, לאלו המטפלים בתרחיפי mycobacteria ומבצעים בדיקות רגישות לתרופות יש שיעורים גבוהים בהרבה של סיכון תעסוקתי לשחפת. ברור כי ישנה חשיבות עליונה לכך שכל צוות המעבדה יהיה מוגן ככל האפשר, ולכן אנו ממליצים בחום שלא לבצע אף אחד מההליכים הללו ללא הגנה נשימתית אישית מתאימה, וכוונتنا היא למסכות בתקן N95.

בנוסף, נדרשת קבינה לבטיחות ביולוגית מסוג class two או מנדף, שבה כל האזורים המנדפים מסוננים דרך מסנני HEPA. לבסוף, מנגנון פשוט החשוב מאוד למניעת תנודות בזרימת האוויר בתוך המעבדה הוא נעילה של דלת המעבדה כדי למנוע כניסה ויציאה של אנשי צוות בזמן עיבוד הדגימות. דבר זה מפחית את הסיכון להדבקה בתוך המעבדה, ולכן אני מקווה שזה סיפק לכם סקירה טובה של מהי מתודולוגיית ה-mods ועד כמה היא עשויה להיות שימושית בסביבות שבהן המשאבים מוגבלים, אך ישנו צורך דחוף באבחון TB ו-MDR TB באיכות גבוהה.

למידע נוסף, ניתן לבקר באתר האינטרנט שלנו, mods peru. org, שם תמצאו את נהלי העבודה הסטנדרטיים המפורטים שלנו ואת מדריך המשתמש ל-mods. בנוסף ל-SOPs לעיבוד דגימות חוץ-ריאתיות, יש לנו גם ספריית תמונות של mycobacterium and tuberculosis, מיקובקטריה אחרת וזיהומים בקטריאליים ופטרייתיים, וכן תוכלו למצוא את אסטרטגיית הבטחת האיכות שלנו ואת הפרוצדורה שאנו ממליצים עליה לצורך הסמכת מעבדות המתחילות להשתמש ב-mods.

לבסוף, קיים דף שאלות נפוצות, ואנו מברכים על כל משוב ממשתמשים המשתמשים כעת ב-mods, מכיוון שמדובר במתודולוגיה איטרטיבית. כפי שהסברנו קודם לכן, זהו מבחן שאינו קנייני, ואנו תמיד מעוניינים בשיפורים שמעבדות אחרות הצליחו להשיג.