La creazione di ambienti definiti gassosi Per studiare gli effetti dell'ipossia sulla
20 luglio 2012
Questo paper come utilizzare camere di ipossia a flusso continuo per generare atmosfere con concentrazioni definite di O 2 Per capire le risposte biologiche a una riduzione dei O 2. Questo sistema è facile da installare e mantenere, e sufficientemente flessibile per adattarsi ad una vasta gamma di O 2 Concentrazioni e sistemi modello
Lo scopo del seguente esperimento è configurare e mantenere una camera ipossica utilizzando un metodo a flusso continuo. Questo si ottiene procurandosi e realizzando i tubi, i flaconi e le camere necessari per la procedura. Come secondo passaggio, collegare la bombola di ossigeno e selezionare la portata per creare il livello desiderato di ipossia.
Idratare il gas facendolo passare attraverso un pallone a bolle riempito con acqua deionizzata. Collegare il gas idratato alla camera da ipossia e posizionare i campioni da testare all'interno della camera per esporli a condizioni di ipossia. Si ottengono risultati che mostrano una letalità embrionale dipendente da Hi F1 in condizioni di ipossia, basata sull'osservazione della vitalità fino all'età adulta.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come le camere a guanti, è che è facile ed economica da realizzare in laboratorio e fornisce una concentrazione precisa e riproducibile di gas nella camera ambientale. Sebbene questo metodo offra informazioni sulla risposta ipossica nel nematode C. elegans, può essere adattato anche ad altri sistemi, inclusi organismi modello di maggiori dimensioni e colture cellulari. Inoltre, può essere utilizzato per studiare altri gas, tra cui anidride carbonica e solfuro di idrogeno.
Questo protocollo illustra come costruire una camera di ipossia. Il gas è immagazzinato in bombole di gas compresso con concentrazioni di ossigeno definite, e viene collegato un regolatore a due stadi. Il gas entra nella parte inferiore del tubo di flusso, uscendo dalla parte superiore al flusso corretto.
Il gas entra quindi nel pallone a bolla, idratando il gas. L'idrogas passa poi nella camera ipossica attraverso la valvola di ingresso, esponendo i campioni all'ipossia. Infine, il gas viene scaricato nell'ambiente attraverso un foro di scarico praticato nella camera.
Una capsula di cristallizzazione in Pyrex o una scatola di tipo arrow pack possono essere utilizzate come corpo della camera ambientale. Il volume del contenitore deve essere mantenuto al minimo e il materiale deve essere impermeabile ai gas. Praticare un foro su un lato del contenitore con una punta al carbonio o al diamante, quindi inserire un raccordo a bocchetta di plastica.
Mescolare l'epossidico prima dell'applicazione sulla scatola e sul raccordo. Quindi ripetere la stessa procedura sul lato opposto del contenitore, con il secondo foro spostato rispetto al primo. Per aumentare il mescolamento turbolento, utilizzare un tubo di diametro esterno di un ottavo di pollice, in FEP o nylon, per collegare le bombole di gas compresso a un dispositivo di controllo del flusso, come un regolatore di portata massica o un rotametro.
I serbatoi di gas devono contenere concentrazioni definite di ossigeno, bilanciate con azoto, secondo uno standard certificato per il contenuto di ossigeno o per condizioni anossiche. Per l'azoto puro, utilizzare un regolatore a due stadi con il secondo stadio impostato alla pressione desiderata. Consultare le istruzioni nel protocollo scritto per la selezione di una portata appropriata.
Quindi collegare il tubo proveniente dal regolatore a due stadi al tubo di flusso che controlla la portata del gas in ingresso nella camera. Le uscite del tubo di flusso sono collegate a un lavatore gassoso con cilindro fritto contenente acqua distillata. Successivamente, collegare il tubo situato sull'altro lato del lavatore a uno dei raccordi della camera ambientale.
Questo idratrà il gas in ingresso nella camera ambientale. Utilizzare grasso da vuoto per sigillare la camera. Quindi posizionare dei pesi sul coperchio della camera per garantire una chiusura ermetica.
Verificare la tenuta tenendo una piccola quantità di acqua nel palmo di una mano guantata contro il raccordo di scarico del gas sulla camera e controllando la formazione di bolle. Per prima cosa, generare popolazioni sincronizzate di sea Elgan. Posizionare da uno a cento adulti GR in una goccia di soluzione alcalina di ipoclorito sulla superficie di una piastra di terreno di coltura per nematodi non seminata.
Lasciare che la soluzione di candeggina venga assorbita dalla piastra dopo un periodo di incubazione di almeno otto ore. Trasferire le larve L1 sincronizzate sulla piastra seminata con batteri OP50 vivi. In alternativa, lasciare che gli adulti GRA depongano le uova sulla piastra per due o tre ore per generare un gruppo di vermi che si svilupperanno in modo sincrono oppure selezionare larve L4 da una popolazione mista per raccogliere embrioni giovani.
Alla fase di due a quattro cellule, utilizzare una lametta per tagliare gli adulti GR in un piccolo volume di acqua, quindi trasferire le uova mediante pipetta a bocca prima di spostare i vermi nella piastra per l'esposizione a condizioni ipossiche. Posizionare un anello di acido palmitico a 10 milligrammi per millilitro in etanolo attorno al bordo delle piastre. Per evitare che i vermi fuoriescano dalla superficie della piastra in agar.
L'acido palmitico precipiterà dalla soluzione. Mentre l'etanolo evapora formando una barriera fisica per garantire uniformità, assicurarsi di sostituire l'acqua nella bottiglia di lavaggio del gas prima dell'esposizione nella camera ambientale. Dopo aver trasferito i vermi sulle piastre, sigillare le piastre all'interno della camera ambientale, avviare il flusso di gas e mantenere l'esposizione per il tempo desiderato per il saggio.
Per valutare la vitalità delle uova fino all'età adulta, lasciare sviluppare i vermi per 48 ore dopo il ritorno all'aria ambiente, momento in cui dovrebbero trovarsi allo stadio di larve di quarta fase o di adulti di un giorno; registrare la vitalità fino all'età adulta. Per visualizzare i vermi sottoposti a esposizione ipossica, trasferire i vermi in una goccia di M nove su un coprioggetto quadrato da 22 millimetri e capovolgerlo su un cuscinetto di agarosio al 2% in M nove, se necessario.
25 millimolari di amol o 10 millimolari di azide di sodio possono essere utilizzati come anestetici. In alternativa, dopo l'esposizione all'ipossia, la camera ambientale trasparente può essere posizionata direttamente sullo stage di un microscopio stereoscopico. Vengono mostrate due viste, una delle quali comprende l'intero sistema di flusso dei gas.
L'altra con soltanto la camera sul portatavolo del microscopio. Coltivare i vermi Bristol N2 su quattro piastre di crescita da 10 centimetri di diametro fino a quando la maggior parte dei vermi raggiunge lo stadio adulto GR. Lavare i vermi in un tubo conico da 15 millilitri con una soluzione di ipoclorito alcalino in rapporto da 1 a 5 e incubare sotto rotazione finché i vermi iniziano a dissolversi.
Non più di cinque minuti. Lavare i vermi tre volte con M nine, centrifugando a 1.500 ×g tra ogni lavaggio senza utilizzare la piastra rotta. Piastrare gli embrioni sbiancati su 8 piastre NGM da 150 millimetri e lasciare sviluppare gli embrioni fino allo stadio di larve L4 per circa 48 ore.
A 22 gradi Celsius, spostare le piastre nella camera ambientale ed esporle a condizioni ipossiche e anossiche per quattro ore o per la durata specificata dal disegno sperimentale. Per raccogliere i campioni rapidamente, rimuovere il coperchio della camera ipossica. Prendere una piastra campione, sigillare nuovamente la camera nel tempo stabilito e registrare le operazioni.
Dopo aver rimosso i vermi dall'ipossia, l'intero processo dovrebbe richiedere meno di due minuti. Utilizzare acqua disdistillata per lavare i vermi su un filtro in nylon e quindi versarli in un tubo conico da 15 millilitri etichettato contenente 100 microlitri di SDS al 1%. Centrifugare i vermi in SDS in una centrifuga da banco a 1.500 ×g per 15-20 secondi.
Con una pausa, utilizzare un vuoto per rimuovere la maggior parte del soprannatante dal tubo, lasciando intatto il pellet di vermi. Trasferire il pellet di vermi con un volume predeterminato di liquido in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL etichettato, utilizzando una pipetta. Se il campione deve essere utilizzato per elettroforesi SDS-PAGE, questo tubo può contenere un volume uguale di colorante di carico proteico 2X; sigillare il tubo e immergerlo in azoto liquido.
Ripetere fino a quando tutti i campioni sono stati isolati. Seguire queste procedure per i campioni di controllo dell'aria ambiente; per garantire coerenza, i campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Questa figura mostra la vitalità degli embrioni esposti a 1000 parti per milione di ossigeno, 5.000 parti per milione di ossigeno e normossia, pari a circa 210.000 parti per milione di ossigeno.
Gli embrioni sono esposti a ciascuna condizione per 24 ore in camere a flusso continuo di ossigeno. I vermi sono stati trasferiti in condizioni normossiche e lasciati sviluppare fino all'età adulta per 48 ore, quindi valutati per la vitalità all'età adulta. Dopo questa procedura, i campioni possono essere raccolti per analisi successive mediante Western blot, QPCR o saggi fisiologici come la durata della vita o la produzione di prole.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara su come impostare una camera da ipossia a flusso continuo nel proprio laboratorio.
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Panoramica
In questo articolo vengono descritte le modalità di configurazione e mantenimento di una camera ipossica mediante un metodo a flusso continuo per creare concentrazioni definite di O2. Il sistema è progettato per essere di facile utilizzo e adattabile a diversi esperimenti biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sull'ipossia
Sfondo
- Comprendere le risposte biologiche ai livelli ridotti di ossigeno è fondamentale.
- Le camere ipossiche permettono studi controllati sulla privazione di ossigeno.
- I metodi a flusso continuo migliorano l'affidabilità delle condizioni ipossiche.
- Studi precedenti hanno mostrato effetti variabili dell'ipossia su diversi organismi.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per generare condizioni di ipossia.
- Indagare gli effetti dell'ipossia su campioni biologici.
- Dimostrare la flessibilità del sistema per diverse configurazioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Realizzazione di tubi, palloni e camere per l'allestimento dell'ipossia.
- Collegamento di una bombola di ossigeno per controllare le portate.
- Umidificazione del gas mediante un pallone a bolle riempito con acqua deionizzata.
- Posizionamento dei campioni da testare nella camera di ipossia per l'esposizione.
Risultati principali
- Dimostrata la capacità del sistema di creare condizioni ipossiche specifiche.
- Osservata letalità embrionale dipendente da Hi F1 in ambienti ipossici.
- I risultati hanno indicato una viabilità variabile fino all'età adulta sotto stress ipossico.
- Convalidata l'efficacia della camera ipossica a flusso continuo.
Conclusioni
- La camera da ipossia a flusso continuo è uno strumento versatile per la ricerca biologica.
- Consente un controllo preciso dei livelli di ossigeno in condizioni sperimentali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'impatto dell'ipossia sullo sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La creazione di condizioni ipossiche precise e riproducibili è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi nei modelli di malattia in cui la tensione di ossigeno influenza l'attività delle vie metaboliche. Questo metodo consente la generazione scalabile ed economica di ambienti definiti di O2 per supportare screening meccanicistici e saggi fenotipici in sistemi geneticamente modificabili. Riducendo la variabilità dell'esposizione all'ipossia, migliora l'affidabilità predittiva nei flussi di lavoro iniziali della scoperta mirati a vie metaboliche sensibili all'ipossia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF-1 in condizioni controllate di concentrazione di O2 per convalidare bersagli sensibili all'ipossia.
- Valore operativo: Permette un campionamento rapido dopo l'esposizione ipossica per catturare modifiche transitorie della segnalazione prima che si invertono.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce condizioni quantitative e riproducibili definite dall'O2 per lo screening di composti che modulano le vie di risposta all'ipossia.
- Valore operativo: La trasparenza della camera consente la visualizzazione in tempo reale delle risposte fenotipiche durante l'esposizione ai gas.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione dose-risposta dei livelli di O2 per mappare gli effetti dipendenti dalla concentrazione sullo sviluppo e sulla sopravvivenza.
- Valore operativo: Adattabile ad altri sistemi modello e gas (ad esempio CO2, H2S) per una modellizzazione fisiopatologica più ampia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio alla validazione del saggio, in particolare per i percorsi modulati dalla disponibilità di ossigeno.
- Biologia della scoperta: Permette un controllo preciso dell'O2 per isolare effetti dipendenti da HIF-1 negli studi di validazione genetica.
- Screening: Genera condizioni ipossiche stabili ed equilibrate, adatte per lo screening di composti ad alta riproducibilità.
- Analisi: Supporta saggi finalizzati alla valutazione della vitalità cellulare, dell'espressione trascrizionale o proteica dopo intervalli ipossici definiti.
- Ricerca traslazionale: Collega la concentrazione di O2 a esiti fenotipici rilevanti per ischemia, microambiente tumorale o disturbi dello sviluppo.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione modulare consente l'adattamento tra diversi laboratori e sistemi modello senza la necessità di rivalidare i principi fondamentali di somministrazione dei gas.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica consentendo esperimenti con titolazione precisa dell'O2 in modelli geneticamente modificabili.
- Valore operativo: Una configurazione a basso costo e di facile realizzazione aumenta l'accessibilità e la standardizzazione tra diversi gruppi di ricerca.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo dati affidabili sulla modulazione del bersaglio a livelli di O2 fisiopatologicamente rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei candidati mirati all'ipossia attraverso letture fenotipiche riproducibili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nella manipolazione dei gas e accesso a bombole di O2/N2 compresse con concentrazioni certificate.
- Si basa su strumentazione per il controllo del flusso (ad esempio, regolatori di portata massici) e materiali per la fabbricazione di camere stagni ai gas.
- Necessita di procedure operative standardizzate (SOP) per la sigillatura della camera, l'idratazione del gas e il caricamento del campione, al fine di garantire la riproducibilità.
- Deve tenere conto dei range di tolleranza all'O2 specifici per ciascun modello durante la trasposizione tra specie o tipi cellulari.
- È limitato dal volume della camera e dalla dinamica del flusso, fattori che possono influenzare il tempo di equilibrazione in formati ad alta produttività.
