L'uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in
3 dicembre 2012
Qui descritto è un In vivo Tecnica di immagine strutture subcellulari in animali esposti ad anossia utilizzando un flusso di gas attraverso la camera microincubation in congiunzione con un microscopio confocale disco rotante. Questo metodo è semplice e flessibile abbastanza per soddisfare una varietà di parametri sperimentali e sistemi modello.
L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere una tecnica in vivo per l'analisi delle dinamiche subcellulari in embrioni di sea elegance esposti a anossia, utilizzando un sistema a flusso gassoso su un microscopio ad alta potenza. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando un campione di animali transgenici giovani adulti per generare una popolazione adeguata di embrioni giovani da sottoporre a imaging. Successivamente, preparare vetrini con pad di agarosio sottile da utilizzare nella camera di micro-incubazione.
Successivamente, i ricci di mare vengono adeguatamente anestetizzati e ricoperti con olio di carbonio alogeno per evitare la disidratazione quando esposti al flusso di gas. Infine, il vetrino circolare contenente gli animali anestetizzati viene posizionato all'interno della camera di microincubazione. La camera viene quindi posta sul palchetto del microscopio e riempita con gas azoto per creare un ambiente anossico durante l'acquisizione delle immagini, utilizzando in definitiva un flusso di gas attraverso la camera di microincubazione.
In combinazione con la microscopia a fluorescenza in vivo, consente di ottenere video e immagini dettagliate ad alta risoluzione dell'arresto del ciclo cellulare in risposta all'anossia. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza indiretta, è che le modifiche subcellulari possono essere documentate in vivo mentre gli animali sono esposti a condizioni specifiche. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'animazione sospesa indotta dall'anossia negli embrioni di elegans.
Può essere applicato anche ad altri sistemi, come lieviti, colture cellulari o embrioni di altri piccoli invertebrati o vertebrati. Possono inoltre essere applicate condizioni aggiuntive, come iperossia, temperatura, stress o trattamento con molecole di piccole dimensioni. A dimostrazione di questa procedura, Anastacia Garcia e Mary Latt, due studentesse laureate del mio laboratorio. Si inizia con una ceppa transgenica di C. elegans appropriata di interesse; in questo studio, verrà utilizzata la ceppa transgenica TH32 per visualizzare cromosomi e centrosomi come marcatori della divisione cellulare.
Generare una popolazione sincronizzata disintegrando adulti gravidi in soluzione di ipoclorito ed utilizzando gli embrioni rimanenti, trasferendo gli adulti gravidi su una piastra seminata e facendo deporre le uova per uno o due ore, oppure selezionando larve L4 da una popolazione mista e trasferendole su una nuova piastra seminata. Coltivare i nematodi a 20 gradi Celsius fino al giovane adulto GR, il che richiederà circa 96 ore dalla schiusa, 72 ore dalle larve L1 o 24 ore dopo la muta da L4. Questa metodologia fornisce un mezzo per generare una popolazione di giovani adulti che contengono un elevato numero di embrioni giovani, i quali presentano grandi blastomeri e nuclei ottimali per l'analisi mediante imaging di cambiamenti subcellulari e subnucleari.
Per preparare una camera umida per contenere i vetrini preparati, posizionare un tovagliolo di carta inumidito all'interno di una grande capsula di Petri o contenitore coperto con un coperchio di dimensioni adeguate. Preparare l'agarosio fuso al 2% in acqua deionizzata riscaldando la miscela in vetreria mediante microonde o bagno d'acqua. Successivamente, posizionare da una a tre gocce di agarosio caldo su un vetrino microscopico pulito, quindi apporre immediatamente un secondo vetrino capovolto perpendicolarmente sopra le gocce di agarosio e premere leggermente in modo che il cuscinetto risultante sia sottile e privo di bolle d'aria.
Dopo che l'aros si è raffreddato, separare lentamente i due vetrini, lasciando la guarnizione aros intatta su uno dei vetrini. È importante assicurarsi che la guarnizione aros sia abbastanza sottile da non interferire con la capacità di mettere a fuoco il microscopio. Successivamente, utilizzare una lametta pulita per modellare la guarnizione aros in un piccolo quadrato.
Conservare le lamelle nella camera umida preparata fino al momento dell'uso. Utilizzando la stessa lametta pulita, prelevare con attenzione il bordo del tampone aros e trasferirlo dalla lamella a un'ampolla circolare da 25 millimetri. Evitare l'accumulo di bolle d'aria sotto l'ampolla circolare, che deve adattarsi correttamente al microincubatore.
Aggiungere una goccia di anestetico sul tampone aros. Prelevare da cinque a dieci vermi e posizionarli nella goccia di anestetico. Attendere da uno a tre minuti affinché i vermi cessino il movimento.
Utilizzando la punta di una pipetta, aggiungere una goccia di olio di carbonio leggero sulla parte superiore dei vermi per prevenire la disidratazione mentre il gas scorre attraverso la camera. Successivamente, collegare un'estremità del tubo di plastica flessibile alla camera. Separare le due metà dell'incubatore microperfusionato chiuso e posizionare con attenzione il vetrino in posizione verticale sull'anello inferiore.
Chiudere saldamente i due lati della camera. Quindi collegare la camera, tramite il tubo flessibile in plastica, alla bombola di gas azoto e posizionarla sul palchetto del microscopio. Verificare la presenza di eventuali perdite assicurandosi che il tubo e i tappi dei connettori lungo il lato della camera siano ben fissati per l'acquisizione delle immagini degli embrioni.
Per prima cosa, localizzare gli animali a basso ingrandimento. Successivamente passare all'ingrandimento superiore appropriato. Per acquisire immagini di blastomeri embrionali negli adulti, utilizzare il laser a 488 nanometri per localizzare la proteina di fusione GFP nelle cellule di interesse.
Per visualizzare una specifica fase dell'arresto del ciclo cellulare, ad esempio la profase tardiva, identificare un blasfemo in una fase precedente della divisione cellulare, come l'interfase tardiva o la profase precoce. Perfundere la camera con gas azoto e continuare a monitorare i blasfemi mentre l'azoto riempie la camera, regolando il piano focale secondo necessità. Eseguire un'acquisizione con microscopia a intervalli per catturare il fenomeno di interesse desiderato in questo caso.
Arresto in profase e ancoraggio dei cromosomi alla membrana nucleare interna. Acquisire immagini ogni 10 secondi per un massimo di 30 minuti. Tipicamente, l'arresto in profase indotto da anossia si verifica entro 20-30 minuti dall'inizio del flusso di gas azoto.
Per documentare il recupero dallo stato di arresto indotto dall'anossia, spegnere il gas e permettere alla camera di tornare alla normossia, registrando nel contempo una serie a intervalli di tempo. La ripresa del ciclo cellulare e la decondensazione dei cromosomi avvengono tipicamente entro cinque-venti minuti. Utilizzare ImageJ o Photoshop per elaborare immagini e video e importarli in QuickTime per la visualizzazione.
All'interno dell'embrione esposto all'anossia, i cromosomi in profase si condenseranno e si allineeranno con la periferia interna della membrana nucleare. Un fenomeno noto come ancoraggio dei cromosomi; al ripristino dell'ossigeno, la progressione del ciclo cellulare riprenderà e i cromosomi in profase proseguiranno il loro normale processo.
Il blasfemo si sposterà dalla periferia nucleare alla piastra equatoriale, indicando il passaggio alla metafase. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore utilizzando animali opportunamente stadiati. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare esclusivamente animali adulti giovani e sani, di dedicare abbastanza tempo per completare l'esperimento e di essere pazienti nell'apprendere a selezionare correttamente i blasfemi opportunamente stadiati.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come catturare eventi subcellulari indotti da anossia in vivo utilizzando embrioni di GaN e una camera con flusso di gas su un microscopio ad alta potenza.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica in vivo per l'immagine della dinamica subcellulare in embrioni di sea elegans esposti a anossia. Il metodo utilizza un flusso gassoso attraverso una camera di microincubazione in combinazione con un microscopio confocale a disco rotante ad alta potenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- L'imaging subcellulare è fondamentale per comprendere le risposte cellulari allo stress ambientale.
- L'anossia può influenzare in modo significativo la dinamica cellulare e la vitalità.
- Caenorhabditis elegans è un organismo modello per studi di biologia dello sviluppo.
- Le tecniche di imaging ad alta risoluzione sono essenziali per osservare i processi dinamici in campioni vivi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per l'immagine di strutture subcellulari in embrioni vivi in condizioni anossiche.
- Migliorare la comprensione delle risposte cellulari alla privazione di ossigeno.
- Fornire una tecnica di imaging flessibile, adatta a diverse configurazioni sperimentali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di elegans marini transgenici adulti giovani per generare embrioni.
- Utilizzo di vetrini con pad di agar sottile in una camera di micro-incubazione.
- Anestetizzazione degli elegans marini con olio di carbonio alogenato per prevenire la disidratazione.
- Acquisizione di immagini mediante microscopio confocale a disco rotante in flusso di gas azoto per creare un ambiente anossico.
Risultati principali
- La tecnica consente l'acquisizione di immagini in tempo reale della dinamica subcellulare negli embrioni.
- Mantenimento con successo delle condizioni anossiche durante l'acquisizione delle immagini.
- Flessibilità dimostrata per diversi parametri sperimentali.
- Forniti nuovi approfondimenti sugli effetti dell'anossia sui processi cellulari.
Conclusioni
- Questo metodo è uno strumento prezioso per lo studio delle risposte cellulari all'anossia.
- Può essere adattato a diversi sistemi modello e condizioni sperimentali.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della dinamica subcellulare in condizioni di stress.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale della dinamica subcellulare in embrioni vivi in condizioni anossiche controllate, fornendo informazioni meccanicistiche sull'arresto del ciclo cellulare indotto da stress. Catturando l'arresto in profase reversibile e l'ancoraggio dei cromosomi in C. elegans, supporta la validazione di bersagli in percorsi che regolano la sospensione animata e la dormienza metabolica. L'approccio offre un sistema rilevante per le malattie per indagare meccanismi di rilevamento dell'ossigeno con affidabilità predittiva nella riduzione del rischio preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche visualizzando l'arresto del ciclo cellulare indotto da anossia in vivo, chiarificando la dinamica delle vie coinvolte nella carenza di ossigeno.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta di cambiamenti subcellulari, senza artefatti da fissazione.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistico collegando l'esposizione all'anossia a parametri quantificabili di progressione del ciclo cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati utilizzando reporter marcati con GFP per l'analisi standardizzata e riproducibile della dinamica della divisione cellulare.
- Risultati quantitativi: Genera dati in time-lapse che permettono di misurare l'insorgenza, la durata e la cinetica di recupero dell'arresto in presenza di gradienti di ossigeno definiti.
- Scalabilità della piattaforma: Si adatta a flussi di lavoro di screening ad alto contenuto per molecole di piccole dimensioni o modificatori genetici che influenzano le vie di risposta allo stress.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella il danno da ischemia-riperfusione e lo stress ipossico in contesti dello sviluppo, in linea con la scoperta di biomarcatori traslazionali.
- Continuità preclinica: Collega la scoperta alla validazione preclinica monitorando le risposte cellulari conservate all'anossia attraverso diversi sistemi modello.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce indicazioni per criteri di avanzamento/interruzione basati su arresto fenotipico reversibile e soglie di recupero.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo dati di imaging su cellule vive che informano studi sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione delle vie metaboliche prima dell'identificazione del composto leader.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di rilevamento dell'ossigeno attraverso la visualizzazione diretta dell'arresto e del recupero del ciclo cellulare negli embrioni.
- Screening: Fornisce sistemi pronti per saggi con letture quantitative sul progresso mitotico, consentendo lo screening di composti in grado di modulare la sospensione animata.
- Analisi: Offre misurazioni risolte nel tempo della durata dell'arresto in profase e della dinamica cromosomica, facilitando l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici modellando le risposte allo stress ipossico rilevanti per ischemia, ictus e disturbi metabolici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile applicabile a lieviti, embrioni vertebrati e sistemi di colture cellulari sotto diversi stress.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità nei collegamenti meccanicistici tra anossia e regolazione del ciclo cellulare.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie al controllo del flusso di gas e alla progettazione della camera ambientale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo consentendo la rilevazione precoce di effetti citotossici o citostatici in sistemi pertinenti alle malattie.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei composti in base al rischio, concentrandosi su quelli che bersagliano le vie del fattore inducibile dall'ipossia (HIF) o le risposte allo stress mitocondriale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione di ceppi transgenici, nella preparazione degli embrioni e nella microscopia a fluorescenza su cellule vive.
- È dipendente dalla microscopia confocale a disco rotante, dai sistemi di controllo del flusso gassoso e dalla manutenzione delle camere ambientali.
- Necessita della standardizzazione dei tempi di esposizione all’anossia, del controllo della temperatura e dei protocolli di recupero tra i diversi gruppi di lavoro.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi sistemi modello, inclusi lo stadio degli embrioni e la compatibilità dei reporter.
- È limitata dalla necessità di utilizzare marcatori fluorescenti tolleranti all’ossigeno e dal potenziale effetto fototossico durante acquisizioni prolungate in time-lapse.
