Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è seguire le cellule fotoconvertite in un embrione di pesce zebra vivente. Questo viene ottenuto innanzitutto incorporando un embrione, che esprime una proteina fluorescente fotoconvertibile specifica per un tessuto, in agarosio a bassa temperatura di fusione. Successivamente, la proteina all'interno della regione di interesse viene completamente fotoconvertita.

Quindi l'embrione viene accuratamente rimosso dall'agarosio e mantenuto in acqua per uova a 28,5 gradi Celsius fino a stadi successivi. Infine, l'embrione fotoconvertito viene nuovamente incorporato in agarosio a bassa temperatura di fusione. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come le cellule fotoconvertite possano essere rilevate con precisione in stadi successivi grazie alla presenza stabile della proteina fotoconvertita mediante microscopia confocale.

Pensiamo quindi che il metodo che presenteremo oggi sarà molto utile nel contesto della biologia cellulare e dello sviluppo. Riteniamo che l'utilizzo di questa metodologia nello studio della migrazione cellulare, della dinamica tissutale e di altri comportamenti cellulari sarà particolarmente vantaggioso. La procedura sarà dimostrata da Veronica Lombardo, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio, dopo l'incrocio di zebrafish transgenici che esprimono una proteina fluorescente fotoconvertibile.

Scegliere gli embrioni più luminosi, che siano omozigoti, e coltivarli a 28,5 gradi Celsius una volta raggiunta la fase desiderata. Utilizzare pinze per rimuovere la corionatura in un contenitore di vetro con acqua per uova, al fine di anestetizzare gli embrioni. Utilizzare una pipetta di vetro o una punta di pipetta tagliata per trasferirli singolarmente in trica.

Trasferire un embrione anestetizzato sul coperchio di una piastra di coltura e mantenerlo nel volume minimo possibile di mezzo. Trasferire l'embrione in agarosio mediante pipettaggio con agarosio a bassa temperatura di fusione all'1% in TRICA a 30 gradi Celsius, quindi posizionarlo in una piastra di coltura con fondo in copertura di vetro. Utilizzare una punta di plastica liscia per orientare l'embrione una volta che l'agarosio si è polimerizzato.

Coprirlo con la soluzione Trica su un microscopio confocale invertito dotato di sorgenti laser a 405, 488 e 561 nanometri e di un obiettivo 20x. Utilizzare i laser a 488 e 561 nanometri per generare uno stack Z dell'intera struttura del campione, che comprende la regione di interesse. Selezionare lo strumento per la serie temporale e impostare due cicli senza intervallo, uno per la fase pre e uno per la fase post conversione fotoindotta.

Selezionare lo strumento della regione e definire una o più regioni di interesse per la conversione fotochimica. Successivamente, selezionare lo strumento di sbiancamento e impostare l'inizio dello sbiancamento dopo la scansione. Uno dei due utilizzati qui è un laser a diodo da 30 milliwatt e 405 nanometri.

Ottimizzato con attenzione per utilizzare la quantità minima di luce laser necessaria per completare la fotoconversione, regolando l'intensità della luce laser, il numero di scansioni della regione di interesse e la velocità di scansione. Scansionare il campione con i laser a 488 nanometri e 561 nanometri per visualizzare la fluorescenza residua verde e quella rossa fotoconvertita della proteina fluorescente fotoconvertibile. Dopo la fotoconversione, scartare la soluzione e, utilizzando un ago o una punta di plastica liscia, rimuovere con cura l'embrione dall'agros.

Mantenere l'embrione in acqua per uova al buio a 28,5 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Incapsulare nuovamente l'embrione, quindi generare un Zack del campione, includendo nuovamente la regione di interesse, utilizzando i laser a 488 e 561 nanometri. Poiché questo protocollo non influisce sullo sviluppo normale, è possibile osservare l'embrione fotoconvertito in stadi successivi.

Di seguito è riportato un esempio di saggio di conversione fotoindotta. Le cellule endoteliali sono state monitorate durante lo sviluppo del pesce zebra da 48 a 72 ore dopo la fecondazione, utilizzando una linea transgenica reporter che esprime kick G all'interno dei nuclei endoteliali, come mostrato qui. Prima della conversione fotoindotta, kick G era espressa nel tessuto endoteliale ed era rilevabile esclusivamente come fluorescenza verde mediante scansioni di controllo con un laser ad argon a 488 nanometri. Scansioni con un laser a 561 nanometri per la fluorescenza rossa non hanno rilevato alcuna kick GR fotoconvertita prima della fotoconversione.

Successivamente, la regione di interesse è stata completamente fotoconvertita utilizzando un laser a diodo da 405 nanometri all'10% di intensità, con 20 iterazioni, e i vasi della testa sono stati nuovamente scansionati mediante i laser a 488 nanometri e 561 nanometri. In questo pannello, il segnale verde G si è completamente trasformato in rosso all'interno della regione di interesse, consentendo di tracciare le cellule endoteliali fotoconvertite in fasi successive. L'embrione è stato osservato a 24 ore dalla fotoconversione, corrispondenti a circa 72 ore post-fertilizzazione, nei tessuti endoteliali derivati dalla regione di interesse fotoconvertita.

Sono state osservate sia le proteine G kick non convertite che quelle convertite fotochemicalmente, a causa della stabilità della forma fotoconvertita rossa di kick g e della sintesi di nuova kick G verde non convertita dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare la biologia cellulare e il rimodellamento dei tessuti in diversi tipi di pesci.