多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

本実験の全体的な目的は、TNF Alphaサイトカイン向けに最適化済みのELISAアッセイをXapプラットフォームに転換し、同時に代替抗体ペアを評価することである。これは、ELISAキットのキャプチャー抗体と、他に3種類の候補キャプチャー抗体を、混合した4種類の異なるマイクロスフィアまたはビーズセットに結合させることで達成される。これら4つのセットを用いることで、4種類の検出抗体を用いて4つすべての候補を同時にテストし、最適な抗体ペアを決定することが可能となる。

次に、最も最適な2組の抗体ペアを用いて2つのXapアッセイを構築します。その後、信号強度、ダイナミックレンジ、および感度の観点から、これらのアッセイの性能を元のEISAアッセイと比較します。その結果、同様の抗体であっても同一条件下で大きく異なる性能を示すこと、またLuminex Xapアッセイを用いることで複数の抗体を同時にスクリーニングできることが示され、本アッセイがEISAと比較して感度とダイナミックレンジが向上していることが明らかになりました。

EIS Aなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、xapベースのイムノアッセイにより、研究者が複数の標的を検査できること、または本例のように、複数の抗体を同時に検査できることです。最適な抗体を特定する方法について、Luminex CorporationのアソシエイトサイエンティストであるErica Lopezが手順を実演します。

書面によるプロトコルに従い、ヒトTNF alphaに特異的な4種類のキャプチャー抗体と4種類の検出抗体を選択し、調製することから本プロトコルを開始してください。また、キャプチャー抗体のホスト種に特異的な確認抗体を1種類調製してください。抗体カップリングキットの試薬を室温に戻しておきます。

カップリング反応に選択したビーズ領域番号を、4本の反応チューブにラベル付けします。4本のバイアルに入ったmag plexマイクロスフィアの内容物を、ラベル付けした4本の反応チューブに移します。各ビーズセットを500 µLの活性化バッファーで2回洗浄し、抗体カップリングキットの記載に従って、sulf ONHSおよびEDC溶液を用いて各ビーズセットを活性化します。

ユーザーマニュアルに従い、ローテーターで20分間インキュベートした後、活性化されたビーズを用いて、500 µLの活性化バッファーで前述の洗浄ステップを計3回繰り返します。洗浄1回につき、500 µLの溶液を4本個別に準備してください。各溶液には7.5 µgのキャプチャー抗体不活化バッファーを含めます。

これら4種類のキャプチャー抗体溶液を、それぞれの反応チューブに加えます。直ちに各チューブをボルテックスし、ローテーターで2時間インキュベートします。抗体カップリングキットに付属の洗浄バッファー500 µLを用いて、抗体が結合したビーズの洗浄ステップを計3回繰り返します。

最終洗浄ステップの後、各反応チューブに洗浄バッファーを500 µL加え、抗体結合ビーズの最終ストック濃度が5 million beads/mLとなるようにボルテックスし、次に反応チューブをソニケーションしてビーズを分散させます。結合反応後に回収されたビーズの数を、細胞カウンターまたは血球計数器を用いて計測します。結合反応による回収率は通常90%を超えます。各セットの結合ビーズストックを用いて、アッセイバッファー中での最終濃度が100 beads/µLとなるテスト溶液を調製し、FICO erything labeled antis speciesの希釈液を調製して、結合反応が成功したことを確認してください。

アッセイバッファーで 4 µg/mL に調製した IgG 確認抗体を用い、ラウンドボトム 96 ウェルプレートの 4 ウェルずつに、各試験溶液を 50 µL ずつ分注し、計 16 ウェルに充填します。次に、バックグラウンドを測定するため 8 つのウェルにアッセイバッファーを 50 µL 加え、残りの 8 ウェルに希釈した確認抗体を 50 µL 加えます。マルチチャンネルピペットを用いて、数回ピペッティングし、反応液を穏やかに混合します。

プレートに蓋をし、プレートシェーカーを用いて室温で30分間インキュベートします。プレートを磁気プレートセパレーターに1〜2分間置き、溶液からビーズを回収します。その後、セパレーターに置いたままプレートを廃棄容器に向けて勢いよく反転させ、液体を除去します。

各ウェルに100 µLのアッセイバッファーを加え、同様の方法でSANEをプレートから除去することで、2回洗浄します。マグネットプレートセパレーターを使用し、マルチチャンネルピペットで5回緩やかにピペッティングして、ビーズを100 µLのアッセイバッファーに再懸濁させます。MAGIXなどのLuminex xMAP装置を用いて分析します。

この反応による蛍光信号の強度はビーズ表面のタンパク質量に正比例するため、ビーズに結合したタンパク質の相対量を迅速に評価できます。xapアッセイにおいて最も効果的な抗体ペアを決定するために、各ビーズセット10 µLを0.96 mLのアッセイバッファーに加えて、4種類すべてのビーズセットの初期混合液を調製します。各抗体をアッセイバッファーで1 µg/mLに希釈し、検出抗体溶液を調製します。

同様にアッセイバッファーとしても使用します。R&D Systems社のTNF alphaタンパク質標準品を2000 pg/mLで調製し、Streptavidin R-Phycoerythrinを8 µg/mLに希釈します。スクリーニングアッセイ用に、CoStarラウンドボトム96ウェルプレートの16ウェル eachに、抗体結合ビーズ混合液を50 µLずつ加えます。

次に、バックグラウンドを測定するため、16ウェルのうち8ウェルにアッセイバッファーを50 µL加えます。続いて、反応を測定するために、残りの8ウェルにTNF alpha標準溶液を50 µLピペッティングします。アッセイプレートシェーカーで振盪しながら、室温・遮光条件下で1時間インキュベートします。

次に、4つのウェルのうち、2つをバックグラウンドウェル、残り2つをレスポンスウェルとし、それぞれのウェルに4種類の検出抗体を50 µLずつ添加します。同様の条件下で30分間インキュベートした後、すべてのウェルにSAPE試薬を50 µL添加します。さらに、同様の条件下で15分間インキュベートします。

プレートをマグネットプレートセパレーターに1分間置きます。次に、セパレーターに置いたままプレートを廃液容器の上で勢いよく反転させ、液体を除去します。16個の各ウェルにアッセイバッファーを100 µLずつピペッティングします。

次に、磁気分離を用いてビーズから液体を除去します。続いて、16個のウェルそれぞれにアッセイバッファーを100 µLずつ加えます。操作手順の詳細についてはユーザーマニュアルを参照し、Luminex mag picks装置でプレートを読み取ります。

所望のシグナル強度を満たす抗体ペアを選択します。最適な捕捉抗体を選択した後、その抗体が結合したビーズストック溶液 100 µL をアッセイバッファーで 10 mL に希釈します。希釈したビーズ 50 µL を、2枚の CoStar ラウンドボトム 96ウェルプレートの 78ウェルに加えます。

各プレートを使用して、異なる検出抗体の性能を評価します。次に、8,000 pg/mLから4 pg/mLまで、12点からなる標準曲線を作成します。R&D Systems社製を使用します。

TNF Alpha標準品について、各希釈液を50 µLずつ6連で各プレートに添加し、さらにバックグラウンドとしてアッセイバッファーを50 µLずつ6ウェルに添加し、1プレートあたり計78ウェルとします。プレートをアッセイプレートシェーカーで振盪させながら、室温・遮光条件下で1時間インキュベートします。その後、最初のプレートの全78ウェルに、第一検出抗体を50 µLずつ添加します。

2枚目のプレート上の2番目の検出抗体についても同様の操作を繰り返します。同じ条件下でプレートを30分間インキュベートします。その後、各プレートのすべてのウェルに50 µLのSAPE試薬を加えます。

2枚のプレートを遮光して15分間振盪させた後、磁気プレートセパレーターに1分間静置します。セパレーターに載せたままプレートを廃棄容器の上で勢いよく反転させ、液体を除去します。次に、磁気ビーズから液体を除去する前と同様に、プレート上の78個のウェルそれぞれにアッセイバッファーを100 µLずつピペットで分注します。

プレート上の78個のウェル each のビーズに 100 µL のアッセイバッファーを添加した後、マグピックス（MagPlex）装置のユーザーマニュアルに従って適切に操作し、プレートを解析します。R&D Systems 社の human TNF Alpha TNF SF1a DUOset ELISA キットに付属の指示に従ってください。R&D キットに付属の標準品によって生成されるレスポンスを測定します。

R&D Systems社のキャプチャー抗体および検出抗体を他社製の抗体に置き換え、ELISAアッセイをさらに3回繰り返します。簡略化のため、抗体はベンダーごとにペアリングし、EISAフォーマットの規定に従って、3種類のTNF Alphaタンパク質標準品を用いて各ペアを独立して評価します。Luminex Xapアッセイは、Mag PLXマイクロビーズに結合したTNF alpha抗体の4セットを組み合わせ、4種類のキャプチャー抗体すべてを混合物として評価するためにマルチプレックスで実施しました。キャプチャー抗体は、4種類のビオチン化検出抗体と個別に評価し、1つの検出抗体と4つのキャプチャー抗体それぞれの相互作用を同時に決定できるようにしました。

結果から、R&D Systems社のDUOセットの抗体ペアが最も優れた性能を示し、得られた応答は6,183の平均蛍光強度（MFI）ユニットであったことが示された。また、Millipore社およびABAM社の検出抗体は、RD Systems社の捕捉抗体と組み合わせた場合にXAPアッセイで妥当な応答を示したが、Millipore社、ACAM社、およびNovus社の捕捉抗体は、XAPアッセイにおいてあまり望ましくない応答を示した。4つの抗体ペアをEISAフォーマットで比較するために、R&D Systems社のDUOセットのプロトコルを用いた。

今日広く用いられている典型的なEIAプロトコルを反映しており、またXAPテクノロジーで使用されるプロトコルに類似しているため、すべての抗体ペアにR&D Systems社のプロトコルを使用しました。EISA試験の結果、R&D Systems社の抗体ペアが再び最良の結果を示しました。抗体反応性の変動を評価したところ、Acam社の抗体ペアでは反応が見られず、Millipore社およびNovas社の抗体ペアでは緩やかな反応が認められました。

標準物質を用いて、4組すべての抗体ペアを、3社の異なるベンダーから提供された3種類のリコンビナントTNF alphaタンパク質標準物質でテストしました。データは、3社のベンダーのリコンビナントTNF alphaタンパク質標準物質が同等の結果を示したことを表しています。ELSAおよびXAPアッセイで標準曲線を作成するには、R&D Systems社のTNF alphaタンパク質を使用しました。

ELI AアッセイにはR&D Systems社の抗体ペアを使用しましたが、XapアッセイではR&D Systems社の捕捉抗体と、R&D Systems社またはMillipore社のいずれかの検出抗体を使用しました。R&D Systems社のTNF alphaタンパク質を希釈し、8,000から4 pg/mLまでの濃度範囲を作成しました。R&D Systems社の抗体ペアを用いたXapアッセイでは、図に示すように20,000 MFIを超える応答が得られ、期待通りの結果となりました。

R&D Systems社の検出抗体の代わりにMillipore社の検出抗体をXapアッセイに使用したところ、応答はR&D Systems社の検出抗体で得られた応答の約30%でした。このチャートの緑色の線はELAの標準曲線を表しており、メーカー推奨のTNF alpha範囲は16から1000 picograms per milliliterでした。分光光度計の制限により、ELISAアッセイの範囲を広げることは不可能でした。

さらに、両手法のダイナミックレンジと感度は、対数スケールでプロットするとより明確に示されます。EISAの応答の傾きとxapアッセイの応答の間には明確な差が見られ、高濃度および低濃度の両方において、ELizaによるTNF alphaの検出能がより限定的であることがさらに示唆されます。2つの機能的TNF alpha xapアッセイにおける検出限界（LOD）は、バックグラウンドに6回の反復測定による標準偏差（SD）の3倍を加えた値よりも高い応答レベルが観察された、最低のTNF alpha濃度を特定することで近似されました。

ここで、R&D Systems社のペアを用いた場合、TNF alphaの最低濃度である3.91 pg/mLにおいて66 MFIの応答が得られ、これが背景値に3 SDを加えた値よりも大きく、この基準を満たしていることが観察できます。Millipore社の検出抗体をR&D Systems社の捕捉抗体と組み合わせて使用した場合、検出限界は7.81 pg/mL未満でした。

この例では、許容可能な応答として得られた2番目に低いTNF alpha濃度が、最も低いTNF alpha濃度の応答にその標準偏差の3倍を加えた値よりも17 MFI高い値を示しました。同様に、r and d systems duo set Elizaの検出限界は63～31 picograms per milliliterの間であると推定されました。この手順に従い、xapアッセイをさらに最適化するために、さまざまなサンプルマトリックスやレポーター中の抗体濃度の試験などの他のステップを実施することができます。