に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する

本実験の目的は、連続フロー法を用いて低酸素チャンバーを設置し、維持することです。これは、手順に必要なチューブ、フラスコ、およびチャンバーを入手し、作製することで達成されます。次に、酸素タンクを接続し、流量を選択して目的の低酸素レベルを作り出します。

脱イオン水を満たしたバブリングフラスコにガスを通過させ、ガスを加湿します。加湿したガスを低酸素チャンバーに接続し、試験サンプルをチャンバーに入れて低酸素条件下に曝露させます。成体までの生存率を観察することにより、低酸素下におけるHi F1依存的な胚致死の結果が得られます。

グローブボックスなどの既存の手法と比較した本技術の主な利点は、研究室で容易かつ安価に作製でき、環境チャンバー内のガス濃度を正確かつ再現性高く制御できることです。この手法は線虫 C elegance における低酸素応答の解明に有用ですが、より大型のモデル生物や細胞培養を含む他の系にも応用可能です。さらに、二酸化炭素や硫化水素などの他のガスを用いた研究にも利用できます。

本プロトコルでは、低酸素チャンバーの構築方法について解説します。ガスは酸素濃度が規定された圧縮ガスボンベに貯蔵され、2段式レギュレーターが取り付けられています。ガスはフローチューブの底部から導入され、適切な流量で上部から排出されます。

その後、ガスはバブルフラスコに流れ込み、ガスが加湿されます。加湿されたガスは流入バルブを通って低酸素チャンバーに入り、サンプルを低酸素状態にさらします。最終的にガスは、チャンバーに開けられた排気孔を通じて室内に放出されます。

環境チャンバーの本体として、Pyrex製結晶化皿またはアローパックボックスを使用できます。容器の容量は最小限に抑え、材質はガス不透過性である必要があります。容器の側面にカーボンまたはダイヤモンドチップドリルで穴を開け、プラスチック製のホースバーブフィッティングを取り付けます。

ボックスおよびフィッティングに塗布する前に、エポキシ樹脂を混合します。次に、容器の反対側で同様の手順を繰り返し、1つ目の穴からオフセットした位置に2つ目の穴を開けます。乱流混合を高めるには、外径1/8インチのFEPまたはナイロンチューブを使用して、圧縮ガスボンベをマスフローコントローラやロトメータなどの流量制御装置に接続してください。

ガスボンベは、酸素含有量の認定標準物質または無酸素条件に基づいた、窒素でバランス調整済みの規定の酸素濃度である必要があります。純窒素を使用する場合は、2段式レギュレーターを使用し、2段目を希望の圧力に設定してください。適切な流量の選択については、書面によるプロトコルの指示を参照してください。

次に、2段式レギュレーターからのチューブを、チャンバーに導入されるガスの流量を制御するフローチューブに接続します。フローチューブの出口は、蒸留水を入れたフリット付きシリンダーを備えたガス洗浄ボトルに接続します。その後、洗浄ボトルの反対側のチューブを環境チャンバーのフィッティングのいずれかに接続します。

これにより、環境チャンバーに導入されるガスが加湿されます。真空グリースを使用してチャンバーを密閉してください。その後、チャンバーの蓋に重りを置き、気密性を確保します。

手袋を着用した手のひらに少量の水を溜め、チャンバーのガス排気口に当てて気泡が発生しないかを確認し、密閉性をテストします。まず、同期させた海生Elganの個体群を作製します。1〜100匹のGR成体を、播種していない線虫増殖培地プレートの表面にあるアルカリ性漂白剤溶液の一滴の中に配置します。

少なくとも8時間のインキュベーション後、漂白溶液をプレートに吸収させます。同期化したL1幼虫を、生きたOP 50細菌を播種したプレートに移します。あるいは、GRA成虫をプレート上で2～3時間産卵させ、同期的に発生する個体群を形成させるか、混在した個体群からL4幼虫をピックアップして若い胚を回収します。

2～4細胞期に、少量の水中でカミソリの刃を用いてGR成虫を細断し、マウスピペットで胚を回収した後、低酸素条件にさらすためにプレートにワームを移します。プレートの縁に10 mg/mLのパルミチン酸エタノール溶液をリング状に塗布します。これは、ワームがアガープレートの表面から脱出するのを防ぐためです。

パルミチン酸が溶液から析出します。エタノールが蒸発して均一性を確保するための物理的なバリアを形成させるため、環境チャンバーに設置する前にガス洗浄瓶の水を必ず交換してください。虫をプレートに移した後、プレートを環境チャンバー内で密封し、ガスの流量を開始して、アッセイに必要な時間だけ曝露を維持します。

胚から成体までの生存率を確認するため、室温の空気に戻した後、線虫を48時間育成させます。この時点で線虫は第4段階幼虫または成体1日目となっているはずであり、成体までの生存率を算出します。低酸素曝露を受けた線虫を可視化するには、線虫を22 mm四方のカバーガラス上のM9緩衝液の一滴に移動させ、必要に応じてM9緩衝液中の2%アガロースパッドの上に反転させて置きます。

麻酔剤として、25 millimolarのamolまたは10 millimolarのアジ化ナトリウムを使用できます。あるいは、低酸素状態にさらした後、透明な環境チャンバーを解剖顕微鏡のステージに直接置くことも可能です。ここでは2つの視点を示しており、1つはガスフロー装置全体を含んでいます。

もう一方は、顕微鏡ステージ上にチャンバーのみを置いた状態にします。Bristol N2系統の線虫を10 cmの高成長プレート4枚で、大半の線虫がGR成体になるまで培養します。線虫を1:5のアルカリ性漂白剤溶液で15 mLコニカルチューブに洗い出し、線虫が溶解し始めるまで回転させながらインキュベートします。

5分以内で行ってください。M9バッファーで線虫を3回洗浄し、各洗浄の間に1,500 ×gで遠心分離します。この際、プレートを振らないようにしてください。漂白した胚を8枚の150 mm NGMプレートに分配し、約48時間かけて胚をL4幼虫まで成長させます。

22 °Cで、プレートを環境チャンバーに移動させ、低酸素または無酸素条件下に4時間、あるいは実験計画で指定された時間だけ曝露させます。サンプルを回収するには、低酸素チャンバーの蓋を素早く取り除きます。サンプルプレートを1枚取り出し、速やかにチャンバーを再密封して、その手順を記録してください。

低酸素状態から線虫を取り出した後、この一連の工程は2分以内に完了させる必要があります。蒸留水を用いて線虫をナイロンフィルター上に洗浄し、1% SDS 100 µLを入れたラベル付きの15 mLコニカルチューブに注ぎます。デスクトップ遠心機を用い、SDS中の線虫を1,500 ×gで15～20秒間遠心分離します。

吸引装置を用いて、チューブから上清の大部分を除去し、線虫ペレットには触れないようにします。ピペットを使用して、規定量の液体とともに線虫ペレットをラベル付きの1.5 µL マイクロチューブに移します。サンプルをSDS-PAGEに使用する場合は、このチューブに2倍濃度のタンパク質ローディングダイと同量の液体を入れ、チューブを密閉して液体窒素に浸します。

すべてのサンプルが分離されるまでこの操作を繰り返します。一貫性を保つため、ハウスエアコントロールサンプルについても同様の手順に従ってください。サンプルは-20 °Cで保存可能です。この図は、1000 ppmの酸素、5,000 ppmの酸素、および約210,000 ppmの酸素である常酸素状態に曝露した胚の生存率を示しています。

胚を連続フロー酸素チャンバー内で、各条件下に24時間曝露させます。その後、虫を常酸素条件に移して成体になるまで48時間発生させ、成体への生存率をスコアリングします。この手順の後、ウェスタンブロット、QPCR、または寿命や子孫産生などの生理学的アッセイによる後続の解析のためにサンプルを回収することができます。

このビデオを視聴することで、ご自身の研究室で連続フロー低酸素チャンバーをどのように構築すればよいか、十分な理解を得ることができるはずです。