DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een microarray-experiment met behulp van een geautomatiseerd mengapparaat. Dit wordt bereikt door eerst de kwaliteit van de RNA-monsters te analyseren met de bioanalyzer na de RNA-amplificatie en -labeling. De RNA-monsters worden vervolgens gehybridiseerd met de microarrays.

Ten slotte worden de gehybridiseerde microarrays gewassen en gescand. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die de differentiële expressie van RNA-transcripten laten zien via analyse van tweekleurige fluorescentie-microarraybeelden. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de hybridisatiestappen van de microarray moeilijk aan te leren zijn vanwege de gespecialiseerde apparatuur.

De kwaliteitscontroleanalyse begint met de voorbereiding van het 2, 100 bioanalyzer-instrument en het chip-primingstation volgens de beschreven procedure. De gelmatrix wordt vervolgens gefilterd door 550 µL te pipetteren in een spinfilter dat wordt geleverd bij de RNA 6, 000 nano kit centrifuge. Het filter wordt gecentrifugeerd bij 1, 500 RCF gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Verdeel vervolgens de gefilterde gel in aliquots van 65 µL, die tot een maand bewaard kunnen worden bij 4 °C. Vortex het kleurstofconcentraat 10 seconden en voeg één µL toe aan een aliquot van 65 µL. Centrifugeer de gefilterde gel na het vortexen van het mengsel 10 minuten bij 13 000 RCF bij kamertemperatuur om de monsters te kunnen analyseren.

Plaats eerst een chip op het primingstation. In deze demonstratie worden RNA 6, 000 nano chipps gebruikt. Breng negen µL van de gelkleurstofmix aan in de put die is gemarkeerd met een witte G tegen de zwarte achtergrond.

Plaats de pipetpunt helemaal onderin de well. Zet de zuiger van de spuit op één milliliter en sluit het primingstation. Druk de zuiger langzaam maar gestaag naar beneden totdat deze door de clip wordt vastgehouden.

Laat de klem na 30 seconden los en laat de zuiger enkele seconden stijgen. Zodra de zuiger stopt, trekt u de zuiger terug naar de positie van één milliliter en opent u het primingstation. Neem negen microliters van de gelkleurstof op.

Meng in elk van de twee putjes. Markeer G. Pipetteer vervolgens vijf µL van de marker in het ladderputje en in elk van de 12 monsterputjes. Laad daarna één µL van de gedenatureerde ladder in het ladderputje en één µL van elk gedenatureerd monster in de monsterputjes.

Voeg tot slot één µL van de marker toe aan elk ongebruikt monsterputje. Zodra deze zijn geladen, wordt de chip gedurende één minuut gevortext bij 2.400 RPM. Plaats de chip en sluit het deksel nadat de 2.100 expert software is gestart.

Zorg ervoor dat de juiste poort is geselecteerd en voer de analyse uit binnen vijf minuten na het laden van de monsters om verdamping te voorkomen. Methoden voor het uitvoeren van RNA-amplificatie en labelen zijn terug te vinden in het geschreven protocol. Zuiver het gelabelde cRNA na het labelen om niet-ingebouwde nucleotiden te verwijderen. Met behulp van cogens r easy mini columns kan het gelabelde cRNA vervolgens worden gekwantificeerd met een NanoDrop 2000 spectrofotometer.

Noteer in de microarray-meetmodus de monsterconcentratie, opbrengst en specifieke activiteit. Voor microarray-hybridisatie is het noodzakelijk om ten minste twee uur voorafgaand aan de hybridisatie een opbrengst van ten minste 825 nanogram en een specifieke activiteit van ten minste acht picomol per microgram te bereiken. Zet het hybridisatiestation aan en stel dit in op 65 °C.

Dit protocol beschrijft het gebruik van Agilent 4x40 4K arrays met het Roche NimbleGen hybridisatiesysteem en vier mengkamers. Na de cRNA-fragmentatie, zoals beschreven in het schriftelijke protocol, dient de hybridisatiekamer te worden voorbereid. Plaats een microarray-dia in het montage- en demontagegereedschap met de barcodezijde naar boven. Open vervolgens een A4-mengkamer en breng de kleefstof aan die de array en het montage- en demontagegereedschap fixeren om elke beweging te voorkomen.

Plaats de A vier mixer op de slide, beginnend aan het verste uiteinde. Zorg ervoor dat deze correct is uitgelijnd met het instrument en bevestig de mixer langs de array. Trek de slide vanaf het uiteinde van de mixer om de slide-mixer-assemblage te verwijderen.

Druk met het wrijfinstrument langs de gehele plakstrip om ervoor te zorgen dat deze stevig op het objectglas is geplakt. Kleine luchtbellen die tussen de plakstrip en het objectglas gevangen zitten, zijn zichtbaar tegen de donkere achtergrond. Neem extra de tijd om deze bellen met het wrijfinstrument te verwijderen.

De array is nu klaar om te worden geladen. Gebruik een positive-displacement pipet om 100 µL van het hybridisatiesample op te nemen. Druk de tip stevig in de opening en doseer langzaam en gelijkmatig, zodat er geen lucht in het arraygebied gevangen raakt.

Wanneer het monster de gehele array bedekt en de vloeistof snel uit de ontluchtingspoort begint te stromen, moet de pipet snel worden verwijderd door alleen de zuiger los te laten. Zodra de tip van de slide is verwijderd, dient het overtollige vloeistof bij beide poorten voorzichtig te worden weggedept, waarbij men er op moet letten dat er geen monster uit de kamer zelf wordt getrokken. Bedek vervolgens de poorten met stickers met behulp van een pincet.

Plaats de objectglas op het hybridisatiestation en controleer of de bladder-openingen correct boven de O-ringen zijn gepositioneerd. Dit waarborgt een goede menging tijdens de hybridisatie. Sluit de afdekking van het objectglas en het deksel van het station.

Stel het station in op mengmodus B en hybridiseer de array bij 65 °C gedurende 17 uur. Zodra dit is voltooid, vult u een glazen schaal gemarkeerd met A met wasbuffer één; de schaal moet groot genoeg zijn om de montage- en demontagetool te bevatten en voldoende ruimte te bieden voor manoeuvres. Alle wasstappen moeten in glaswerk worden uitgevoerd, aangezien plastic de neiging heeft verbindingen uit te lekken, wat resulteert in een hoge achtergrondruis in de array.

Plaats een objectglashouder en een roerstaafje in een kleurbakje. Vul het bakje, aangeduid als B, met wash buffer one tot de houder is bedekt en plaats het bakje op een roerplaat bij kamertemperatuur. Voeg daarnaast een roerstaafje toe aan een leeg kleurbakje, aangeduid als C, en plaats dit op een roerplaat.

Verwijder de array uit het hybridisatiestation en plaats deze in het montage- en demontagehulpmiddel. Dompel de gehele assemblage onder in schaal a, terwijl u met één hand het montage- en demontagehulpmiddel en de slide aan tegenovergestelde zijden vasthoudt. Pel de A four mixer voorzichtig af, waarbij u er op let dat u het arraygebied niet beschadigt.

Plaats het objectglas snel op het rek en in kleuringsbak B. De blootstelling aan de lucht moet worden geminimaliseerd, aangezien de SCI-vijf-kleurstof gevoelig is voor ozon. Was het preparaat gedurende één minuut terwijl u op gemiddelde snelheid roert. Vul kleuringsbak C met voorverwarmde wasbuffer twee.

Verplaats de objectglaasjes en was deze gedurende één minuut. Verwijder na het wassen het objectglashouderrek zeer langzaam uit kleurglas C om te voorkomen dat er druppels op de glazen achterblijven. Droog het objectglas door het twee minuten te centrifugeren.

Plaats de slide vervolgens in een conische buis van 50 milliliter en vul deze met argongas; scan onmiddellijk met een gene picks 4, 000 B scanner van molecular devices om signaalverlies te voorkomen, zoals getoond. Hier zijn voorbeelden van vier RNA-monsters geïsoleerd uit het menselijk brein. De kwaliteit van het tumorweefselmonster werd beoordeeld met de 2, 100 bioanalyzer op een RNA 6, 000 chip.

Gevulde en open pijlpunten geven respectievelijk de positie van de 18 s en 28 S-R-R-N-A species aan. Het RNA-integriteitsgetal of RIN is een kwantitatieve meting van de RNA-kwaliteit. Totaal RNA-monsters van goede kwaliteit moeten slechts twee grote pieken produceren wanneer ze in een bioanalyzer voor kwaliteitscontrole worden geanalyseerd, wat overeenkomt met de twee belangrijkste ribosomale RNA-species.

Sommige RNA-degradatie zal zichtbaar zijn als een veeg vóór de eerste ribosomaal RNA-piek en een significant lagere piek voor ernstig gedegradeerd 28 S-R-R-N-A. RNA van lage kwaliteit zal een brede piek of een reeks pieken bij lage retentietijden vertonen. Terwijl de twee ribosomaal RNA-pieken een zeer lage intensiteit zullen hebben of helemaal niet identificeerbaar zullen zijn.

Arrays van goede kwaliteit zouden een hoog signaal moeten produceren bij relatief lage PMT-waarden. Van de meeste transcripten wordt verwacht dat ze in vergelijkbare hoeveelheden aanwezig zijn in het experimentele monster en het referntiemonster. Massale, wijdverspreide veranderingen in genexpressie zullen waarschijnlijk geen enkele biologische betekenis hebben.

Daarom moet het grootste deel van de array er eerder geel uitzien dan groen of rood. Signalen van goede kwaliteit moeten zich bovendien in een dynamisch bereik bevinden zodanig dat de signaalhistogrammen volledig overlappen, zoals te zien is in de scatterplot van de array-afbeelding. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een microarray-experiment uitvoert met een geautomatiseerd hybridisatieapparaat.