Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Het algemene doel van deze procedure is het volgen van gefotoschakelde cellen in een levend zebravisembryo. Dit wordt bereikt door eerst een embryo, dat een weefselspecifiek fotoconverteerbaar fluorescent eiwit tot expressie brengt, in laagsmeltende agarose in te bedden. Vervolgens wordt het eiwit binnen het gebied van interesse volledig gefotoconverteerd.

Vervolgens wordt het embryo voorzichtig uit de agarose verwijderd en bewaard in eierwater bij 28,5 °C tot aan latere stadia. Ten slotte wordt het gefotoconverteerde embryo opnieuw ingebed in agarose met een laag smeltpunt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen waaruit blijkt dat gefotoconverteerde cellen in latere stadia nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd middels confocale microscopie, dankzij de stabiele aanwezigheid van het gefotoconverteerde eiwit.

We denken dat de methode die we vandaag presenteren zeer nuttig zal zijn in de context van cel- en ontwikkelingsbiologie. We geloven dat het gebruik van deze methodologie in de context van celmigratie, weefseldynamiek en ander celgedrag erg waardevol zal zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Veronica Lombardo, een postdoc uit mijn laboratorium, na het kruisen van transgene zebravisjes die een fotoconverteerbaar fluorescent eiwit tot expressie brengen.

Kies de helderste embryo's die homozygoot zijn en kweek deze bij 28,5 °C zodra ze het gewenste stadium hebben bereikt. Gebruik een pincet om ze in een glazen bakje met eيwater te ontshellen om de embryo's te anesthetiseren. Gebruik een glazen pipet of een afgeknipt pipetpuntje om ze één voor één over te brengen naar trica.

Kring een geanesthetiseerde embryo over naar de bodem van een kweekschaal en houd het embryo in het kleinst mogelijke volume medium. Plaats het embryo in agros door het te pipetteren met 1% laagsmeltende agros met trica bij 30 graden Celsius, en plaats het in een kweekschaal met een glazen bodem. Gebruik een gladde plastic tip om het embryo te oriënteren zodra de agros is gepolymeriseerd.

Bedek het met Trica-oplossing op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met laserbronnen van 405, 488 en 561 nanometer en een 20 x objectief. Gebruik de 488 en 561 nanometer lasers om een Z-stack van de volledige structuur van het monster te genereren, inclusief het gebied van interesse. Selecteer de tool voor tijdsseries en stel deze in op twee cycli zonder interval, één voor vóór en één voor na de fotoconversie.

Selecteer de regiostool en definieer één of meer regio's van interesse voor fotoconversie. Selecteer vervolgens de bleaching-tool en stel in om het bleken na de scan te starten. Een van de twee gebruikte tools is een 30 milliwatt 405 nanometer diadelaser.

Zorgvuldig geoptimaliseerd voor de minimale hoeveelheid laserlicht die nodig is voor volledige fotoconversie, wat wordt bereikt door de intensiteit van het laserlicht, de scaniteraties van het interessegebied en de scansnelheid te variëren. Scan het monster met de 488 nanometer en 561 nanometer lasers om eventuele resterende groene en de gefotoconverteerde rode fluorescentie van het fotoconverteerbare fluorescerende eiwit te visualiseren. Verwijder na fotoconversie de oplossing en haal het embryo voorzichtig uit de agaro met behulp van een naald of een gladde plastic tip.

Houd het embryo in eierwater in het donker bij 28,5 graden Celsius tot de gewenste ontwikkelingsfase. Bed oud het embryo een tweede keer en maak vervolgens een Z-stack van het specimen, inclusief het gebied van interesse, opnieuw met gebruik van de 488 en 561 nanometer lasers. Omdat dit protocol de normale ontwikkeling niet beïnvloedt, is het mogelijk om het gefotoconverteerde embryo in latere stadia te observeren.

Hier is een voorbeeld van een fotoconversie-assay. Endotheelcellen werden gevolgd tijdens de ontwikkeling van zebravissen van 48 tot 72 uur na bevruchting met behulp van een transgene reporterlijn die kick G tot expressie bracht in endotheelkernen, zoals hier getoond; vóór de fotoconversie werd kick G tot expressie gebracht in het endotheelweefsel en was dit alleen detecteerbaar als groene fluorescentie met behulp van een 488 nanometer argonlaser. Controle-scans met een 561 nanometer laser voor rode fluorescentie detecteerden geen gefotoconverteerde kick GR vóór de fotoconversie.

Aansluitend werd het interessegebied volledig gefotoconverteerd met behulp van een 405 nanometer diodelasersysteem bij 10% intensiteit en 20 iteraties, waarna de vaten in de kop opnieuw werden gescand met de 488 nanometer en 561 nanometer lasers. In dit paneel was green kick G binnen het interessegebied volledig overgegaan naar rood om de gefotoconverteerde endotheelcellen in latere stadia te volgen. Het embryo werd waargenomen 24 uur na fotoconversie, wat overeenkomt met ongeveer 72 uur na bevruchting, binnen de endotheelweefsels die voortkomen uit het gefotoconverteerde interessegebied.

Zowel niet- als fotogekonverteerde kick G-eiwitten werden waargenomen vanwege de stabiliteit van het rood fluorescerende fotogekonverteerde kick G en de synthese van nieuw groen niet-gekonverteerd kick G na de ontwikkeling ervan. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsbiologie om de celbiologie en weefselremodellering in verschillende vissen te onderzoeken.