Konstrukcje FSL: prosta metoda modyfikowania powierzchni komórek/wirionów za pomocą szeregu markerów biologicznych bez wpływu na ich żywotność

Ogólnym celem tej procedury jest bezpieczne i szybkie znakowanie powierzchni żywych komórek lub S za pomocą konstrukcji bioaktywnych. Jest to osiągane poprzez wstępne przygotowanie roztworu funkcjonalnego spacera, lipidu lub konstrukcji FSL. Następnie równą część roztworu konstrukcji miesza się z równą częścią roztworu komórek lub VIR.

W trzecim kroku mieszaninę inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37 °C. Ostatnim etapem jest przemycie zmodyfikowanych komórek lub cytów lub zmodyfikowanych VIR lub VIR i wykorzystanie ich w doświadczeniach w sposób rutynowy. Ostatecznie komórki żywe z modyfikacją powierzchniową lub S można wizualizować za pomocą wszystkich rutynowych technik analizy eksperymentalnej, w tym cytometrii przepływowej, mikroskopii i aglutynacji.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie kowalencyjne, jest to, że jest ona szybka, niezawodna, elastyczna i nie wpływa na żywotność zmodyfikowanej komórki lub organelli. Aby przygotować roztwór zapasu konstruktu FSL, najpierw dodaj jeden mililitr rozcieńczalnika do fiolki z produktem w celu reconstitution suchego produktu FSL, tworząc roztwór zapasu o stężeniu jeden miligram na mililitr. Sonicuj fiolkę przez 30 sekund, podziel roztwór zapasu na 100 µL sterylne pojemniki i przechowuj je w temperaturze od dwóch do ośmiu °C przez maksymalnie jeden tydzień.

Aby przygotować robocze roztwory konstruktu FSL do insercji bezpośrednio przed użyciem, ponownie poddaj roztwór sonikacji przez 30 sekund w celu homogenizacji wszelkich skupień komórek, a następnie rozcieńcz konstrukt FSL i bufor do wymaganego stężenia. Roztwór roboczy przechowuj w temperaturze od dwóch do ośmiu stopni Celsiusjusza przez maksymalnie tydzień. Po resuspensji w mediach wolnych od lipidów lub w PBS, odwiruj komórki przeznaczone do modyfikacji FSL, aby usunąć niezwiązane lipidy. Następnie osadź komórki w 100 mikrolitrach rozcieńczalnika; komórki kontrolne przemyj w tych samych warunkach do uzyskania 100 mikrolitrów niezmodyfikowanych komórek.

W razie potrzeby dodać 100 µL odpowiedniego rozcieńczenia roztworu FSL. Równolegle należy przygotować kontrole negatywne z niepowiązanymi roztworami FSL oraz/lub PBS. Następnie inkubować wszystkie subpopulacje komórek przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C po inkubacji.

Wypłucz wszystkie komórki dwukrotnie w medium wolnym od lipidów lub w PBS, aby usunąć wszelkie wolne konstrukty FSL, a następnie przygotuj odpowiednią zawiesinę w medium wolnym od lipidów. Po zakończeniu procesu modyfikacji FSL, komórki mogą być przechowywane w temperaturze od czterech do ośmiu stopni Celsjusza. Konstrukty FSL składają się z trzech głównych komponentów: funkcjonalnej głowy lub F, która może być różnymi biologicznie aktywnymi grupami.

Dystanser RS został zaprojektowany w celu oddalenia funkcjonalnej główki od błony w celu poprawy dyspersyjności w wodzie oraz aby był nieaktywny w kontakcie z ludzką surowicą i lipidem DAL lub L, co pozwala konstruktowi na spontaniczną inkorporację w powierzchnie cztery. Reprezentatywne grupy FSL przedstawiono na następnych pięciu obrazach. Żywe embriony mysie zostały bezpośrednio znakowane fluoresceiną FSL przez 2 h w temperaturze 37 °C w bezsurowicznym medium hodowlanym, a następnie przemyte i poddane obserwacji pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Na tym pierwszym obrazie widoczny jest lustrzany zarodek w stadium dwóch komórek, pozbawiony zop palita. Intensne barwienie w środkowej części zarodka jest charakterystyczne dla klasycznego barwienia ciałka polarnego. Na kolejnych dwóch obrazach przedstawiono lustrzane zarodki w stadium czterech i ośmiu komórek, pozbawione zop palita, w których widoczne jest niewyraźne barwienie komórek znajdujących się poza płaszczyzną ostrości mikroskopu.

Na ostatnim obrazie przedstawiono zarodek z lustrzanym odbiciem w stadium 16 komórek, wolny od zop palita. Na następnej serii obrazów widoczne są nienaruszone zarodki z lustrzanym odbiciem w wieku od czterech do pięciu dni, w których zarówno zarodek, jak i zop LUCITA zostały oznakowane FSL fluoresceiną. Przedstawiono znakowanie FSL fluoresceiną u danio pręgowanego. Pierwszy obraz to mikroangiografia larwy danio pręgowanego w 52. godzinie po zapłodnieniu, której do krwioobiegu wstrzyknięto bezpośrednio FSL fluoresceinę.

Tutaj można zaobserwować barwienie naczyń krwionośnych danio pręgowanego. Fluoresceina FSL, heterogeniczne komórki tkanki nerek danio pręgowanego lub cyty ZK zostały przygotowane ex vivo, a następnie wstrzyknięte mikrostrzykawką do krwiobiegu biorcy, którym był embrion danio pręgowanego w 52. godzinie po zapłodnieniu. Obserwacje in vivo cytów ZK przeprowadzono dwie godziny po wstrzyknięciu, obrazując naczynia krwionośne w świetle fluorescencyjnym przy użyciu mikroskopii poklatkowej. Przedstawiono pojedynczą klatkę wideo, w której pomarańczowe strzałki wskazują duże, powoli poruszające się lub nieruchome komórki, a zielone strzałki wskazują komórki szybko poruszające się, które ze względu na ruch wydają się rozmyte. Na tym obrazie pokazano oznakowanie fluoresceiną FSL poprzez doustne pobranie konstruktu, osiągnięte poprzez zanurzenie embrionów danio pręgowanego w medium zawierającym fluoresceinę FSL przez okres do pięciu dni.

Mikroskopia w polu jasnym zarodków zebrafish traktowanych fluoresceiną FSL po lewej stronie odpowiada sąsiadującemu obrazowi fluorescencyjnemu po prawej stronie. Fluorescencja była zlokalizowana głównie w przewodzie pokarmowym. W pokazanych tutaj embrionach kontrolnych, nietraktowanych, nie zaobserwowano barwienia.

Tutaj przedstawiono wirusa zapalenia pęcherzykowego jam ustnych (VSV) bezpośrednio znakowanego 10 µg/mL fluoresceiny FSL przez dwie godziny w temperaturze 37 °C, a następnie utrwalonego 4% paraformaldehydem; analiza za pomocą skanowania faktów wykazała brak oczyszczania wirusa VSV po znakowaniu FSL. Na tym histogramie przedstawiono komórki jąder świni zainfekowane ludzkimi wirusami H1N1 (szczep A Puerto Rico 8 19 34) znakowanymi fluoresceiną FSL.

Niefluoryzujące komórki niezakażone są reprezentowane przez czarną linię, natomiast fuzja hemaglutyniny H1N1 z komórkami świń, która doprowadziła do fluorescencji, jest wskazana przez linię czerwoną. W tej kolejnej serii obrazów komórki zostały najpierw znakowane biotyną FSL przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, następnie przemyte i poddane reakcji z awidyną znakowaną Fluor 4, a następnie przemyte i zamontowane na mokro do mikroskopii fluorescencyjnej. Pierwszy obraz przedstawia złożony obraz konfokalny blastocysty mysiej, a ta figura pokazuje centralny przekrój konfokalny embrionu z poprzedniego obrazu.

Tutaj przedstawiono żywe, ruchome ludzkie plemniki. Rozmycie jest wynikiem ich ruchu. Bardziej wyraźny obraz reprezentatywny ludzkich plemników utrwalonych w 4% paraformaldehydzie po wprowadzeniu można zobaczyć na tej rycini tutaj.

Przedstawiono ludzkie erytrocyty znakowane biotyną FSL; utwierdzenie w 4% paraformaldehydzie przed wprowadzeniem nie wpływa na znakowanie FSL, co zilustrowano na dwóch poniższych rycinach. Tutaj można zaobserwować komórki ludzkiego raka endometrium RL 95 utwierdzone w 4% paraformaldehydzie. Natomiast na tym obrazie komórki ludzkiego raka endometrium RL 95 nie są utwierdzone. Między dwoma obrazami, z utwierdzeniem i bez niego, nie obserwuje się praktycznie żadnych różnic w znakowaniu.

Po lewej przedstawiono RBC cytes znakowane biotyną FSL, zaobserwowane w próbce krwi pobranej dwie godziny po dożylnej infuzji komórek; po prawej te same komórki widziane w mikroskopii świetlnej, a następnie to samo pole widzenia w mikroskopii fluorescencyjnej, gdzie dwie obecne cytes są zidentyfikowane kolorem zielonym. Obliczanie stosunku cytes do nieznakowanych komórek może służyć jako wskaźnik przeżywalności. Ostatni obraz komórek znakowanych biotyną FSL przedstawia żywe ludzkie biotin cytes endometrium, wizualizowane poprzez wiązanie z kuleczkami abated.

Ta ostatnia seria obrazów przedstawia interakcje konstruktu FSL z markerami grup krwi. Pierwszy obraz przedstawia ludzkie erytrocyty GLI pokryte stężeniem 500 µg/mL FSLG, przetestowane przeciwko rozcieńczeniom ludzkiego surowicy. Ludzkie erytrocyty naturalnie nie reagują z antygenem Xena GALI.

W związku z tym cytes mogą być wykorzystywane do ilościowego oznaczenia poziomu przeciwciał w surowicy. W niniejszym przykładzie ustalono, że pacjent posiada miano antygenu wynoszące 1:32, tworząc cytes o malejących poziomach FSL. Podobnie jak w przypadku wyznaczania miana antygenu, można określić optymalny poziom antygenu do wykrycia przeciwciał oraz stworzyć komórki, które dadzą wynik dodatni tylko wtedy, gdy poziom przeciwciał przekroczy określone miano.

Poziom antygenu FSL wymagany do uzyskania wyniku dodatniego zależy od jakości i poziomu wykrywanego przeciwciała. Zazwyczaj w przypadku antygenów węglowodanowych roztwór FSL o stężeniu 100 µg/ml spowoduje silną reakcję dodatnią. Ludzkie erytrocyty grupy 0 zmodyfikowane tak, aby posiadały określony poziom antygenu a, lub tzw. zestawy standaryzowane.

Komórki testowe (cytes) są wykorzystywane do dokładnego i powtarzalnego oznaczania miana przeciwciał anty-A w ludzkiej surowicy. W tym przykładzie komórki testowe przygotowano z własnych erytrocytów dawcy, a poziom anty-A w badanej surowicy grupy O określono jako 1:32. Przedstawiono tutaj w szóstej probówce, jak jednoczesne wprowadzenie antygenów grup krwi A i B do pojedynczej próbki erytrocytów grupy O pozwoliło na stworzenie komórek testowych typu A słaby, B słaby.

Komórki te mogą być wykorzystywane do kontroli jakości VO. Analiza specjalnie przygotowanych komórek grupy A-słabej oraz B-słabej przetestowanych przeciwko odczynnikom anty-A i anty-B wykazuje oczekiwane słabe reakcje, co przedstawiono na tej ilustracji, gdzie reakcje zachodzą w środkowej dolnej części probówek. Tę prostą technikę można przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania.