Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Niniejszy artykuł wideo opisuje procedurę pozyskiwania profili glikozylacji 20 różnych glikoprotein z próbki surowicy pacjenta z rakiem hepatokomórkowym przy użyciu mikroarray przeciwciał z chemicznie zablokowanymi glikanami. W pierwszej kolejności przeciwciała specyficzne dla glikoprotein są naniesione bezpośrednio na płytki mikroarray, a glikany przeciwciał są blokowane, aby zapobiec wiązaniu lektyn. Po naniesieniu próbek surowicy pacjenta, glikoproteiny z próbki są wychwytywane przez przeciwciała. Następnie dodawane są biotynilowane białka wiążące glikany w celu wykrycia glikanów, a następnie dodawany jest koniugowany z neutrawidyną detektor w celu znakowania biotynilowanych lektyn.

Następnie przesuwa się lampkę z mikromacierzą w celu zeskanowania i wykrycia fluorescencji; analiza uzyskanych danych ujawnia profile glikozylacji białek z próbki. Technika ta posiada kilka zalet w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak HPLC. Metoda ta umożliwia wykrycie poszczególnych glikoprotein w ich stanie natywnym.

Szybsze i łatwiejsze jest jednoczesne badanie zmian w glikozylacji wielu białek. Stwierdziliśmy, że biomarkery chorób, w szczególności nowotworów i raka wątroby, które analizowaliśmy najdokładniej, są często glikozylowane. Zauważyliśmy również, że zdolność do wykrywania specyficznych glikoform znacznie poprawia skuteczność biomarkerów w zakresie ich czułości i swoistości.

W związku z tym pomiar ten może dostarczyć informacji o zmianach w glikozylacji wielu białek surowiczych w HCC. Może on zostać zastosowany również w badaniach patologicznych i poszukiwaniu biomarkerów w innych nowotworach i chorobach, takich jak rak trzustki, cukrzyca oraz choroba Alzheimera. Procedurę zademonstruje Chen Lu, technik z mojego laboratorium.

Rozpocznij ten protokół od przygotowania mikroarray przeciwciał; najpierw w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 0,8 ml na lodzie rozcieńcz wszystkie przeciwciała, które będą wykorzystane do druku mikroarray, do stężenia 0,5 mg/ml w minimum 40 ml PBS. W tym przypadku jako kontrola pozytywna zostanie wykorzystanych 26 różnych przeciwciał. Przygotuj również taką samą ilość biotynilowanego BSA w PBS o stężeniu 0,5 mg/ml. Za pomocą pipety odmierz 40 ml każdego przeciwciała do płyty źródłowej z 384 dołkami na lodzie.

Następnie w oprogramowaniu sterującym mikroarray wyznacz położenie każdego przeciwciała. Potem załaduj płytkę na urządzenie do mikroarray jako źródło. Następnie załaduj 20 szkiełek mikroarray do tkanek na urządzenie do mikroarray jako cel.

Skonfiguruj mikroarray tak, aby wydrukować 48 identycznych macierzy cząstkowych, w których 27 przeciwciał i białek kontrolnych jest nanoszonych w trzech powtórzeniach w układzie dziewięć na dziewięć. Uruchom proces drukowania szkiełek do mikroarray przeciwciał. Zbierz szkiełka z mikroarray przeciwciał i przechowuj je w kasecie na szkiełka z osuszaczem.

Zamknij kasetę w plastikowej torebce, aby zapobiec denaturacji białek oraz osadzaniu się wilgoci na szkiełkach podczas przechowywania. Przechowuj szczelnie zamknięte szkiełka z mikromacierzami w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu ich użycia. Najtrudniejszym i najważniejszym elementem całej procedury jest etap blokowania chemicznego.

Aby zapewnić sukces, krytyczne jest naniesienie odpowiedniej ilości przeciwciał na podłoże mikroarray. Zawsze należy przygotować świeży roztwór jodku sodu i kwasu azotowego bezpośrednio przed eksperymentem. Należy również pamiętać, aby przeprowadzić procedurę utleniania w temperaturze 4 °C, unikając ekspozycji na światło.

Wyjmij preparaty mikroarray z lodówki i pozostaw je na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury. Wyjmij jeden preparat z pudełka do przechowywania. Zanurz go na krótko w naczyniu z roztworem PBS z dodatkiem 0,1% tween 20.

Następnie zanurz preparat w 15 mM buforze octanu sodu z dodatkiem 0,1% tweeny na 10 minut. W kolejnym kroku przygotuj świeży roztwór 150 mM nadwęglanu sodu w 15 mM buforze octanu sodu i przelej go do kuwety do płukania preparatów. Przechowuj w lodówce, chroniąc przed światłem do momentu użycia. Wyjmij preparat z buforu octanu sodu i umieść go w kuwecie zawierającej świeży nadwęglan sodu, stroną z przeciwciałami skierowaną do góry.

Przykryć kuwetę folią aluminiową, aby zapobiec dostępowi światła. Następnie umieścić kuwetę z preparatem w temperaturze 4 °C przy łagodnym wstrząsaniu przez dwie godziny. Wyjąć preparat z kuwety i krótko wypłukać go w buforze octanu sodu trzykrotnie przez pięć minut.

Inkubować preparat na szkiełku w 300 ml świeżo przygotowanego 10 mM roztworu blokującego kwasu glutaminowego w komorze inkubacyjnej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu. Wyjąć szkiełka z komory i przemyć je PBS z 0,1% tween przez trzy minuty. Następnie, w kuwecie do mycia szkiełek, inkubować szkiełko z mikroarray w 300 ml 1% BSA w PBS z 0,5% tween przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym wstrząsaniu.

Przepłucz preparaty w PBS z 0,1% tween trzy razy przez trzy minuty. Umieść preparat na statywie do slajdów i wiruj z prędkością 1 200 ×g przez dwie minuty, aby osuszyć slajd z mikromacierzą. W celu oddzielenia poszczególnych podmacierzy na slajdzie odciskano siatkę woskową.

Po wstępnym podgrzaniu urządzenia do odcisków woskowych w temperaturze 70 °C przez pięć minut, należy umieścić zablokowane slajd mikromacierzy w urządzeniu stroną z przeciwciałami skierowaną w stronę wosku. Delikatnie pociągnij za uchwyt, aby równomiernie odcisnąć wosk na slajdzie. Metodę tę można zastosować zarówno do przeprowadzania analiz profilowania glikanów dla pojedynczej próbki, jak i do pomiaru pojedynczego epitopu glikanowego w wielu próbkach.

W niniejszym materiale zaprezentujemy analizy profilowania glikowego. Należy rozpocząć od rozcieńczenia 40 µL surowicy w 360 µL buforu PBS zawierającego 0,1% tween 20, 0,1% bridge 35 oraz po 100 µg/mL IgG mysiego, szczurzego, króliczego, koziego i osiołkowego. Taka objętość jest wystarczająca do naniesienia 6 µL roztworu rozcieńczonej surowicy na każdą podmacierz.

Ostrożnie nanieś 6 µL rozcieńczonej próbki lub kontroli na każdy podzespół matrycy na szkiełku. Inkubuj szkiełko w zwilżonej kasecie z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Przepłucz szkiełko trzykrotnie przez trzy minuty w PBS z 0,1% tween.

Następnie wysusz preparat, wirując go z prędkością 1200 ×g przez dwie minuty. W probówce mikroodśrodkowej o pojemności 0,8 ml na lodzie przygotuj 20 µL biotynilowanych białek wiążących glikany w stężeniu 10 mg/mL w PBS tween. Nanieś 6 µL rozcieńczonych biotynilowanych lektyn na każdy podzespół macierzy na szkiełku i inkubuj w nawilżonej kasecie do szkiełek z mokrymi ręcznikami papierowymi w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Po trzykrotnym wypłukaniu preparatów w PBS z 0,1% tween, analogicznie jak poprzednio, osusz preparat poprzez wirowanie w wirówce przy 1200 ×g przez dwie minuty. W probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,8 ml na lodzie przygotuj 400 µL neutravain znakowanego DITE 5 49 w stężeniu 10 mg/mL w PBS z 0,1% tween. Za pomocą pipety wielokrotnej nanieś 6 µL neutravain znakowanego DITE 5 49 na każdą macierz i inkubuj preparat w nawilżonej kasecie do szkiełek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę po inkubacji.

Płucz preparat trzy razy przez trzy minuty w PBS z 0,1% tween. Osusz preparat, wirując go w wirówce przy 1200 ×g przez dwie minuty. Zeskanuj preparat za pomocą fluorescencyjnego skanera mikromacierzy z rozdzielczością 10 millimeter.

Ustawienia lasera i PMT powinny być tak wysokie, jak to możliwe, przy jednoczesnym zapewnieniu braku nasycenia sygnału. Otwórz obraz w programie array Pro 3.2. Skonfiguruj szablon macierzy zgodnie z mapą macierzy wskazującą położenie plamek przeciwciał.

Należy starannie dopasować każdy okrąg szablonu do odpowiadającej mu plamki na obrazie, a następnie wyeksportować intensywność każdej plamki do pliku Excel w celu przeprowadzenia dalszej analizy. Mikromacierze przeciwciał zawierające 48 identycznych podmacierzy z 26 przeciwciałami przeciwko 20 glikoprotein serum oraz streptawidynie i BSA zostały zaprojektowane i wykonane zgodnie z opisem w tym filmie, aby zbadać znaczenie procedury blokowania.

W analizie profilowania glikoprotein przygotowano dwa identyczne szkiełka do mikromacierzy. Jedno z nich nie zostało zablokowane chemicznie, natomiast drugie tak. Próbkę kontrolną nanieśli na macierze podłoża w kolumnach pierwszej i trzeciej, a połączoną próbkę surowicy HCC nanieśli na macierze podłoża w kolumnach drugiej i czwartej.

Następnie na każdą podmacierz naniesiono biotynilowane lektyny specyficzne dla różnych glikanów, co przedstawiono na obrazach podmacierzy. Lektyny związały się z przeciwciałami przechwytującymi w kolumnach kontrolnych, co spowodowało wysokie tło, nierozróżnialne od kolumn z naniesionym surowicą w mikrotablicach nieblokowanych. Jednakże, gdy ten sam eksperyment przeprowadzono na chemicznie blokowanej płytce mikrotablicy przeciwciał, w kolumnach kontrolnych nie odnotowano wiązania lub było ono bardzo niskie, natomiast w kolumnach z naniesionym surowicą zaobserwowano wysokie wiązanie antygenów.

Wyniki te dowodzą, że procedura blokowania chemicznego jest krytycznym etapem pomiaru glikanów w glikoproteinach wychwyconych przez przeciwciała. Po opanowaniu protokołu możliwe jest uzyskanie profili glikozylacji 22 glikoprotein w surowicy z HCC. Technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Przeciwciała po modyfikacji mogą utracić powinowactwo do swoich antygenów oraz inne właściwości.

Warto zatem o tym pamiętać i stosować kilka różnych przeciwciał z różnych źródeł podczas wykonywania tej procedury. W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zmiana glikozylacji wynika ze zmiany poziomu ekspresji białek, czy wyłącznie z samej zmiany glikozylacji każdego poszczególnego białka, można przeprowadzić dodatkowe pomiary, np. oznaczanie stężenia każdego białka z wykorzystaniem tej samej płytki do mikroanalizy. Należy pamiętać, że praca z próbkami surowicy zawierającymi patogeny może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak rękawice ochronne.