Badanie funkcji kanałów potasowych Kv7 w mięśniach gładkich tętnic z wykorzystaniem elektrofizjologii patch-clamp i myografii ciśnieniowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar aktywności kanałów potasowych KV7 w świeżo dysocjowanych komórkach mięśni gładkich tętnicy krezkowej oraz powiązanie go z pomiarami średnicy tętnicy zarejestrowanymi w warunkach fizjologicznych. Osiąga się to najpierw poprzez chirurgiczne usunięcie łuku naczyniowego krezki u szczura. Drugim krokiem jest wypreparowanie i oczyszczenie segmentów tętnic krezkowych.

Następnie niektóre fragmenty są wykorzystywane do izolowania pojedynczych komórek mięśni gładkich w celu przeprowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych metodą patch-clamp dla prądów potasowych KV7. Ostatnim krokiem jest kanulacja nienaruszonych fragmentów tętnic w celu wykonania pomiarów miograficznych ciśnieniowych w celu oceny skurczu lub rozszerzenia tętnic w odpowiedzi na farmakologiczne modulatory kanałów potasowych KV7. Ostatecznie połączenie elektrofizjologii patch-clamp i miografii ciśnieniowej służy do wykazania, w jaki sposób wzrost lub spadek aktywności kanałów potasowych KV7 wpływa na skurcz tętnic krezkowych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie kanałów klonalnych ekspresywnych w liniach komórkowych, jest fakt, że prądy są rejestrowane z niehodowanych komórek, które natywnie ekspresują te kanały, a prądy KV mogą być izolowane od innych klas kanałów potasowych, które mogą być aktywowane w tych samych komórkach. Myografia ciśnieniowa pozwala na rejestrację odpowiedzi funkcjonalnych z tej samej tkanki, z której pochodzą izolowane komórki, a metoda ta jest bardziej czuła i bardziej fizjologiczna niż inne preparaty, takie jak pierścienie tętnicze lub paski tętnicze. Dr Bareth Mani, stażysta postdoktorski z mojego laboratorium, zaprezentuje techniki kaniulacji tętniczej i myografii ciśnieniowej, a dr Luba Brueggeman, profesor asystent ds. badań w moim laboratorium, zaprezentuje procedury izolacji komórek i techniki patch-clamp.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć nożyczek chirurgicznych do odcięcia odcinków o długości od 10 do 12 centymetrów z obu końców jelita cienkiego szczura. Następnie należy wyizolować jelito wraz z przytwierdzonym unaczynieniem. W kolejnym kroku należy przypiąć odcinek jelita cienkiego.

Rozłóż krezkę na bliższej stronie komory w taki sposób, aby główna gałąź górnej tętnicy krezkowej znajdowała się w centrum, a kolejne rzędy odgałęzień promieniowały od środka. Następnie umieść piny wyłącznie na segmentach jelit, obserwując je przez oświetlony mikroskop sekcyjny. Ostrożnie usuń tkankę tłuszczową oraz tkankę łączną otaczającą tętnice od drugiego do czwartego rzędu w pobliżu jelit, używając mikropincety i nożyczek.

Przytrzymaj sąsiednie żyły, aby ułatwić usunięcie tkanki tłuszczowej i tkanki łącznej oraz uniknąć niepotrzebnego rozciągania tętnic. Następnie przenieś dwa do trzech segmentów tętnicy krezkowej do 35 milimetrowej szalki do hodowli tkanek zawierającej dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Po ustawieniu szalki na lodzie, potnij segmenty tętnicy krezkowej na kawałki o długości od trzech do czterech milimetrów, używając pipety Pasteura z wypalonym końcem.

Przenieś segmenty tętnic do szklanej fiolki zawierającej dwa mililitry podgrzanego do 37 °C roztworu izolującego. Następnie inkubuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po 30 minutach ostrożnie odessij roztwór izolujący o temperaturze 37 °C za pomocą pipety Pasteura.

Dodaj do niego dwa mililitry ciepłego roztworu enzymu, a następnie inkubuj przez 35 minut w temperaturze 37 °C. Bezpośrednio po 35-minutowej inkubacji w roztworze enzymu umieść fiolkę na lodzie, odessaj roztwór enzymu i dodaj dwa mililitry lodowatego roztworu izolacyjnego. Powtórz tę procedurę cztery razy.

Następnie w jednym mililitrze lodowatego roztworu izolacyjnego delikatnie pipetuj segmenty tętnic za pomocą wypolerowanej pipety z tylnym końcem, powtarzając tę czynność od 10 do 20 razy, aby uwolnić pojedyncze komórki mięśni gładkich tętnic krezkowych. Okresowo weryfikuj wygląd miocytów, nakładając kroplę zawiesiny komórkowej na szalkę o średnicy 35 milimetrów i obserwując je pod mikroskopem.

Zdrowe komórki mięśni gładkich tętnicyy (MA SMCs) powinny mieć gładki, wydłużony wygląd. Następnie, za pomocą wypolerowanej pipety Pasteura, przenieś około 100 do 200 µL zawiesiny komórkowej do komory rejestracyjnej i pozwól komórkom przytwierdzić się przez 15 minut. W tym kroku napełnij końcówkę pipety do patch-clampowania wewnętrznym roztworem wolnym od amfoterycyny B, zanurzając końcówkę pipety w roztworze.

Następnie zastosuj ssanie z drugiej strony za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej za pomocą odcinka rurki, dodając roztwór pipetujący z góry. Użyj końcówki mikro-loadera, aż pipeta zostanie wypełniona roztworem w połowie. Usuń pęcherzyki powietrza, delikatnie stukując pipetą.

Następnie włóż pipetę do uchwytu elektrody. Używając mikromanipulatora, opuść pipetę na powierzchnię wydłużonego miocytu. Gdy oporność pipety wzrośnie do poziomu od 6 do 10 MΩ, zastosuj ssanie, aby uzyskać tzw. giga seal.

Jednocześnie ustaw napięcie podtrzymujące na zero milivoltów, oczekując na perforację błony. Następnie zastosuj 100 milisekundowe skoki napięcia do plus 10 milivoltów, a następnie do minus 10 milivoltów. Użyj wzmacniacza, aby skompensować szybki przejściowy prąd pojemności pipety pojawiający się równocześnie z pojawieniem się pojemności całej komórki.

Przejściowe, niewielkie, utrzymujące się prądy dodatnie od 2 do 10 pA, ich polaryzacja i amplituda wskazują na obecność funkcjonalnych kanałów KV7. Pomyślna perforacja za pomocą amfoterycyny B zredukuje oporność dostępu do 35 MΩ lub mniej. Aby zarejestrować zależność prądu od napięcia dla kanałów KV7, należy zastosować pięciosekundowe skoki napięcia w zakresie od -84 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów KV7 jest minimalne, do +16 mV, przy którym prawdopodobieństwo otwarcia kanałów KV7 osiąga plateau. Po pięciu sekundach przy każdym napięciu testowym należy powrócić do napięcia podtrzymującego wynoszącego -4 mV na 10 sekund.

W tej procedurze luźno zawieś po dwie przygotowane wcześniej cienkie szwy nylonowe po każdej stronie. Obok szklanej kaniuli ostrożnie przenieś wypreparowany fragment tętnicy krezkowej z komory do sekcji do komory z graftem mięśniowym pod ciśnieniem, trzymając jeden koniec segmentu za pomocą mikropincety. Następnie, obserwując preparat przez oświetlony mikroskop sekcyjny, przytrzymaj jeden koniec segmentu tętnicy i delikatnie nasuń go na lewą szklaną kaniulę.

Zabezieczyć koniec za pomocą szwów nylonowych. Następnie delikatnie przepłukać światło naczynia cieczą, aby usunąć krew i zanieczyszczenia. Zawór przy lewej strzykawce należy zamknąć, tak aby po tej stronie powstała statyczna kolumna cieczy, względem której regulowane będzie ciśnienie z prawej strony; używając mikromanipulatora, ustawić ruchomą prawą kaniulę szklaną bliżej segmentu tętnicy i naciągnąć prawy koniec segmentu na nią.

Na koniec zabezpiecz odcinek tętnicy szwami nylonowymi i odetnij nadmiar nici chirurgicznych. Następnie zamontuj jednostkę rejestrującą ciśnienie na stole nad mikroskopem do mikrografii ciśnieniowej. Połącz kolumnę ciśnieniową z prawą stroną komory rejestrującej, a następnie nałóż pokrywę na komorę.

Stopniowo podnoś strzykawka 10 ml w ciągu 15 minut i sprawdzaj szczelność naczynia, aż przetwornik ciśnienia P1 wskaże wartość 80 mmHg. W razie potrzeby skoryguj odległość między kaniulami; odległość ta powinna być dostosowana tak, aby podciśnieniowy segment tętnicy był w przybliżeniu prosty i tworzył kształt przypominający ramię w miejscach zawiązania węzłów. Sprawdź żywotność zamontowanego naczynia, stosując krótkotrwałą superfuzję 60 mM chlorku potasu przez 30 sekund. Żywotne naczynie gwałtownie obkurcza się po dodaniu chlorku potasu i natychmiast rozszerza po jego wypłukaniu.

Następnie należy dodać skoncentrowaną substancję testową do roztworu w kąpieli, delikatnie pipetując ją w przód i w tył w pobliżu końca komory, aby wymieszać substancję testową z roztworem, uzyskując odpowiednie stężenie końcowe w 10-mililitrowej komorze. Zmiany objętości w średnicy naczynia po dodaniu substancji testowej można monitorować na obrazie wideo na żywo, a także śledzić w oknie analizy obrazu podczas trwania eksperymentu. Rysunek ten przedstawia rodzinę sekwencyjnych zapisów prądowych zarejestrowanych w odpowiedzi na skoki napięcia przed traktowaniem (zaznaczone na czarno) oraz po stabilizacji w obecności 100 nanomolarnego jonu cynku w pojedynczym miocycie tętnicy krezkowej (zaznaczone na czerwono); przedstawione są tutaj reprezentatywne prądy dla kontroli oraz dla 100 nanomolarnego jonu cynku.

Szare paski wskazują przedział czasowy, w którym mierzono średnie amplitudy prądu. Dla wykresów zależności prądu od napięcia kroki napięcia są zaznaczone po prawej stronie grotami strzałek. Przedstawiono przebieg czasowy wzmocnienia prądu KV7 przez 100 nM jonów cynku, mierzony za pomocą ciągłej metody clampy napięciowej przy -20 mV. Tutaj przedstawiono średnie krzywe zależności prądu od napięcia wyprowadzone z gęstości prądów KV7 zarejestrowanych przed, w trakcie traktowania 100 nM jonów cynku oraz w trakcie traktowania 10 µM blokerem kanałów KV7 XC 9 9 1; pokazano rozkurcz tętnicy krezkowej wstępnie skurczonej 100 pM argyniny wazopresyny indukowany jonami cynku.

Rysunek ten przedstawia przebieg czasowy zmian średnicy zewnętrznej naczynia w odpowiedzi na podanie 100 pM argawazopresyny, a następnie podanie 100 nM jonów cynku. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania tętnic do izolacji pojedynczych komórek lub do myograficznego pomiaru ciśnieniowego skurczu i rozkurczu tętnic. Ponadto powinni Państwo wiedzieć, jak rejestrować prądy KV7 w izolacji od innych prądów w świeżo wyizolowanych miocytach tętniczych.