Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest śledzenie komórek poddanych fotoprzekształceniu w żywym embrionie danio prążkowanego. Osiąga się to poprzez najpierw osadzenie embrionu wykazującego ekspresję tkankowo specyficznego, fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie białko w obszarze zainteresowania zostaje całkowicie poddane fotokonwersji.

Następnie zarodek jest ostrożnie usuwany z agarozy i utrzymywany w wodzie do jaj 28,5°C aż do późniejszych etapów rozwoju. Na koniec fotokonwertowany zarodek jest ponownie zatapiany w agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące, że dzięki stabilnej obecności fotokonwertowanego białka, komórki poddane fotokonwersji mogą być precyzyjnie wykrywane w późniejszych etapach za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Sądzimy, że metoda, którą zaprezentujemy dzisiaj, okaże się bardzo użyteczna w kontekście biologii komórki i biologii rozwoju. Uważamy, że zastosowanie tej metodologii w badaniach nad migracją komórek, dynamiką tkanek oraz innymi zachowaniami komórkowymi będzie niezwykle pomocne. Procedurę zademonstruje Veronica Lombardo, postdoc z mojego laboratorium, po skrzyżowaniu transgenicznych danio pręgowanych wykazujących ekspresję fotokonwertowalnego białka fluorescencyjnego.

Wybierz najjaśniejsze embriony o genotypie homozygotycznym i hoduj je w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną pożądany stopień rozwoju. Użyj pęsety, aby usunąć otoczki z embrionów w naczyniu szklanym z wodą do jaj, w celu ich znieczulenia. Za pomocą pipety szklanej lub odciętego końcówki pipety przenoś embriony pojedynczo do trica.

Przenieś znieczulony zarodek na pokrywkę naczynia hodowlanego i utrzymuj go w jak najmniejszej objętości pożywki. Przenieś zarodek do agrosu, pipetując go w 1% niskotopliwym agrosie z trica w temperaturze 30 °C, a następnie umieść go w naczyniu hodowlanym z przeszklonym dnem. Po spolimeryzowaniu agrosu użyj gładkiego plastikowego tipsa, aby odpowiednio zorientować zarodek.

Przykryj próbkę roztworem Trica na odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w źródła laserowe o długościach fali 405, 488 i 561 nanometrów oraz obiektyw 20x. Użyj laserów 488 i 561 nanometrów do wykonania stosu Z (Z stack) całej struktury preparatu, obejmującego obszar zainteresowania. Wybierz narzędzie serii czasowej i ustaw dwa cykle bez odstępów czasowych: jeden przed i jeden po fotokonwersji.

Wybierz narzędzie wyboru obszaru i zdefiniuj jeden lub więcej obszarów zainteresowania do konwersji zdjęć. Następnie wybierz narzędzie do wybielania i ustaw rozpoczęcie procesu wybielania po skanowaniu. Jednym z dwóch użytych tutaj urządzeń jest laser diodowy o mocy 30 milliwatt i długości fali 405 nanometr.

Procedurę starannie zoptymalizowano pod kątem minimalnej ilości światła laserowego niezbędnej do całkowitej fotokonwersji, co osiągnięto poprzez dobór intensywności światła laserowego, liczby iteracji skanowania obszaru zainteresowania oraz prędkości skanowania. Przeskanuj próbkę laserami o długości fali 488 nanometrów i 561 nanometrów, aby zwizualizować pozostałą zieloną fluorescencję oraz czerwoną fluorescencję fotokonwertowanego białka fluorescencyjnego. Po fotokonwersji wylej roztwór i za pomocą igły lub gładkiej plastikowej końcówki ostrożnie wyjmij embrion z agarozy.

Przechowywać embrion w wodzie jajowej w ciemności w temperaturze 28,5 °C aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Ponownie zanurzyć embrion, a następnie wykonać obraz Z-stack preparatu, obejmujący obszar zainteresowania, ponownie wykorzystując lasery 488 i 561 nm. Ponieważ protokół ten nie wpływa na prawidłowy rozwój, możliwe jest obserwowanie fotokonwertowanego embrionu w późniejszych stadiach.

Oto przykład analizy konwersji fotochemicznej. Komórki śródbłonka śledzono podczas rozwoju rybek zebrafish od 48 do 72 godzin po zapłodnieniu, wykorzystując transgeniczną linię reporterową wykazującą ekspresję kick G w jądrach komórek śródbłonka. Jak pokazano tutaj, przed konwersją fotochemiczną kick G był wykazany w tkance śródbłonka i wykrywalny jedynie jako zielona fluorescencja przy użyciu argonowego lasera o długości fali 488 nm. Skanowanie kontrolne laserem o długości fali 561 nm w celu wykrycia czerwonej fluorescencji nie wykazało obecności konwertowanego fotochemicznie kick GR przed przeprowadzeniem konwersji.

Następnie obszar zainteresowania został całkowicie poddany fotokonwersji przy użyciu lasera diodowego o długości fali 405 nm z intensywnością 10% i 20 iteracjami, a naczynia głowy zostały ponownie przeskanowane za pomocą laserów o długościach fali 488 nm i 561 nm. Na tym panelu widać, że w obszarze zainteresowania sygnał zielonego białka G całkowicie zmienił się na czerwony, co pozwoliło na śledzenie fotokonwertowanych komórek śródbłonka na późniejszych etapach. Zarodek obserwowano 24 godziny po fotokonwersji, co odpowiada około 72 godzinom po zapłodnieniu, w obrębie tkanek śródbłonka pochodzących z fotokonwertowanego obszaru zainteresowania.

Obserwowano zarówno nieprzeksformowane, jak i przekształcone fotochemicznie białka kick G ze względu na stabilność czerwonego fluorescencyjnego przekształconego fotochemicznie białka kick G oraz syntezę nowego zielonego nieprzeksformowanego białka kick G po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii rozwoju do zgłębiania biologii komórki i przebudowy tkanek u kilku gatunków ryb.