Criando ambientes definidos gasosos para estudar os efeitos da hipóxia na
20 de julho de 2012
Este artigo detalha como usar contínuo fluxo de câmaras de hipóxia para gerar atmosferas com concentrações definidas de O 2 Para entender as respostas biológicas à diminuição da O 2. Este sistema é fácil de configurar e manter, e flexível o suficiente para atender uma ampla gama de O 2 Concentrações e sistemas modelo
O objetivo do seguinte experimento é montar e manter uma câmara de hipóxia utilizando um método de fluxo contínuo. Isso é conseguido mediante a obtenção e fabricação dos tubos, frascos e câmaras necessários para o procedimento. Como segundo passo, conecte o tanque de oxigênio e selecione a taxa de fluxo para criar o nível desejado de hipóxia.
Hidrate o gás passando-o por um frasco de bolhas contendo água deionizada. Conecte o gás hidratado à câmara de hipóxia e coloque as amostras de teste na câmara para expô-las a condições hipóxicas. São obtidos resultados que mostram letalidade embrionária dependente de Hi F1 na hipóxia, com base na observação da viabilidade até a fase adulta.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como caixas de luvas, é que ela é fácil e barata para fabricar em laboratório e fornece uma concentração precisa e reprodutível de gases na câmara ambiental. Embora este método forneça informações sobre a resposta hipóxica no nematódeo C. elegans, ele também pode ser adaptado a outros sistemas, incluindo organismos modelo maiores e culturas celulares. Além disso, pode ser usado para estudar outros gases, incluindo dióxido de carbono e sulfeto de hidrogênio.
Este protocolo demonstra como construir uma câmara de hipóxia. O gás é armazenado em cilindros de gás comprimido com concentrações definidas de oxigênio, e um regulador de dois estágios é acoplado. O gás entra pela parte inferior do tubo de fluxo e sai pelo topo na vazão correta.
O gás então flui para o frasco de bolhas, hidratando o gás. O gás hidrogenado passa então para a câmara de hipóxia pela válvula de entrada, expondo as amostras à hipóxia. O gás finalmente é liberado no ambiente através de um orifício de exaustão perfurado na câmara.
Um recipiente de cristalização de Pyrex ou uma caixa de flechas pode ser usado como corpo da câmara ambiental. O volume do recipiente deve ser mantido no mínimo, e o material deve ser impermeável a gases. Faça um furo em um dos lados do recipiente com uma broca de ponta de carbono ou diamante e instale um adaptador de mangueira plástica.
Misture o epóxi antes da aplicação na caixa e no encaixe. Em seguida, repita o mesmo procedimento no lado oposto do recipiente, com o segundo orifício deslocado em relação ao primeiro. Para aumentar a mistura turbulenta, utilize um tubo de diâmetro externo de um oitavo de polegada, de FEP ou náilon, para conectar os tanques de gás comprimido a um dispositivo de controle de fluxo, como um controlador de fluxo de massa ou um medidor de rotor.
Os tanques de gás devem conter concentrações definidas de oxigênio, equilibradas com nitrogênio, conforme um padrão certificado para teor de oxigênio ou para condições anóxicas. Para uso de nitrogênio puro, utilize um regulador de duas etapas, com a segunda etapa ajustada à pressão desejada. Consulte as instruções no protocolo escrito para selecionar uma taxa de fluxo apropriada.
Em seguida, conecte a tubulação do regulador de duas etapas ao tubo de fluxo que controla a taxa de fluxo do gás que entra na câmara. As saídas do tubo de fluxo são conectadas a um frasco de lavagem de gases com cilindro fritado contendo água destilada. Em seguida, conecte a tubulação do outro lado do frasco de lavagem a uma das conexões da câmara ambiental.
Isso irá umidificar o gás que entra na câmara ambiental. Use graxa para vácuo para selar a câmara. Em seguida, coloque pesos sobre a tampa da câmara para garantir um selamento hermético.
Teste o selo mantendo uma pequena quantidade de água na palma da mão com luva contra o encaixe de escape de gás na câmara e verifique a presença de bolhas. Primeiro, gere populações sincronizadas de Elgan marinho. Coloque de um a 100 adultos GR em uma gota de solução alvejante alcalina sobre a superfície de uma placa de meio de crescimento para nematoides sem semeadura.
Deixe a solução de hipoclorito penetrar no meio após um período de incubação de pelo menos oito horas. Transfira as larvas L1 sincronizadas para a placa semada com bactérias OP50 vivas. Alternativamente, permita que adultos GRA depositem ovos na placa por duas a três horas para gerar um grupo de vermes que se desenvolverão de forma sincronizada ou selecione larvas L4 de uma população mista para coletar embriões jovens.
Na fase de duas a quatro células, utilize uma lâmina de barbear para cortar adultos de GR em um pequeno volume de água e, em seguida, transfira os embriões com uma pipeta de boca antes de transferir os vermes para a placa para exposição a condições hipóxicas. Coloque um anel de ácido palmítico a 10 miligramas por mililitro em etanol ao redor da borda das placas. Para impedir que os vermes escapem da superfície da placa de ágar.
O ácido palmítico sairá da solução. À medida que o etanol evapora, formando uma barreira física para garantir uniformidade, certifique-se de substituir a água no frasco lava-gases antes da exposição na câmara ambiental. Após transferir os vermes para as placas, feche as placas na câmara ambiental, inicie o fluxo de gás e mantenha a exposição pelo tempo desejado para o ensaio.
Para avaliar a viabilidade dos embriões até a fase adulta, permita que os vermes se desenvolvam por 48 horas após o retorno ao ar ambiente, momento em que deverão estar em estágio de larva quarta instar ou adultos de um dia; nesse ponto, avalie a viabilidade até a fase adulta. Para visualizar os vermes após exposição hipóxica, transfira-os para uma gota de M nove em uma lamínula quadrada de 22 milímetros e inverta sobre uma almofada de agarose 2% em M nove, se necessário.
25 milimolar de amol ou 10 milimolar de azida de sódio podem ser usados como anestésicos. Alternativamente, após a exposição à hipóxia, a câmara ambiental transparente pode ser colocada diretamente sobre a platina de um microscópio estereoscópico. Duas vistas são mostradas, uma incluindo todo o conjunto de fluxo de gás.
O outro apenas com a câmara sobre a platina do microscópio. Cultive vermes Bristol N2 em quatro placas de crescimento de 10 centímetros de diâmetro até que a maioria dos vermes esteja na fase adulta de GR. Lave os vermes para um tubo cônico de 15 mililitros com uma solução alcalina de hipoclorito na proporção de 1:5 e incube com rotação até que os vermes comecem a se dissolver.
Não mais de cinco minutos. Lave os vermes três vezes com M nove, centrifugando a 1.500 × g entre cada lavagem, sem placa de ruptura. Coloque os embriões clorados em oito placas NGM de 150 milímetros e permita que os embriões se desenvolvam até larvas L4 por cerca de 48 horas.
A 22 graus Celsius, transfira as placas para a câmara ambiental e exponha às condições hipóxicas e anóxicas por quatro horas ou pelo tempo especificado pelo delineamento experimental. Para coletar as amostras, remova rapidamente a tampa da câmara hipóxica. Retire uma placa de amostra e refeche a câmara, anotando o tempo e registrando os passos.
Após remover os vermes da hipóxia, todo esse processo deve levar menos de dois minutos. Use água destilada para lavar os vermes para um filtro de náilon e, em seguida, despeje em um tubo cônico de 15 mililitros rotulado, contendo 100 microlitros de SDS 1% centrifugado. Os vermes em SDS são centrifugados em uma centrífuga de bancada a 1.500 × g por 15 a 20 segundos.
Com uma pausa, use uma bomba de vácuo para remover a maior parte do sobrenadante do tubo, deixando o pellet de vermes intocado. Usando uma pipeta, transfira o pellet de vermes com um volume predeterminado de líquido para um tubo microfugão de 1,5 mL devidamente identificado. Se a amostra for utilizada para eletroforese SDS-PAGE, este tubo pode conter um volume igual de corante de carga proteica duas vezes concentrado. Feche bem o tubo e imerja-o em nitrogênio líquido.
Repita até que todas as amostras tenham sido isoladas. Siga estes procedimentos para amostras de controle de ar ambiente; amostras de consistência podem ser armazenadas a menos 20 graus Celsius. Esta figura mostra a viabilidade de embriões expostos a 1000 partes por milhão de oxigênio, 5.000 partes por milhão de oxigênio e normoxia, em torno de 210.000 partes por milhão de oxigênio.
Os embriões são expostos a cada condição por 24 horas em câmaras de oxigênio com fluxo contínuo. Os vermes foram transferidos para condições normóxicas, permitindo-se que se desenvolvessem até a fase adulta por 48 horas, e então foram avaliados quanto à viabilidade até a fase adulta. Após este procedimento, as amostras podem ser coletadas para análises subsequentes por Western blot, QPCR ou ensaios fisiológicos, como determinação de longevidade ou produção de prole.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como montar uma câmara de hipóxia de fluxo contínuo em seu próprio laboratório.
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Visão Geral
Este artigo detalha como montar e manter uma câmara de hipóxia utilizando um método de fluxo contínuo para criar concentrações definidas de O2. O sistema foi projetado para ser de fácil uso e adaptável a diversos experimentos biológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa em hipóxia
Antecedentes
- Compreender as respostas biológicas a níveis baixos de oxigênio é fundamental.
- Câmaras de hipóxia permitem estudos controlados da privação de oxigênio.
- Métodos de fluxo contínuo aumentam a confiabilidade das condições hipóxicas.
- Estudos anteriores demonstraram efeitos variáveis da hipóxia em diferentes organismos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método confiável para gerar condições hipóxicas.
- Investigar os efeitos da hipóxia em amostras biológicas.
- Demonstrar a flexibilidade do sistema para diferentes configurações experimentais.
Métodos Utilizados
- Fabricação de tubos, frascos e câmaras para a montagem de hipóxia.
- Conexão de um tanque de oxigênio para controlar as taxas de fluxo.
- Umidificação do gás através de um frasco de bolhas preenchido com água deionizada.
- Colocação das amostras de teste na câmara de hipóxia para exposição.
Resultados Principais
- Demonstrou a capacidade do sistema de criar condições hipóxicas específicas.
- Observou letalidade embrionária dependente de Hi F1 em ambientes hipóxicos.
- Os resultados indicaram viabilidade variável até a fase adulta sob estresse hipóxico.
- Validou a eficácia da câmara de hipóxia de fluxo contínuo.
Conclusões
- A câmara de hipóxia de fluxo contínuo é uma ferramenta versátil para pesquisa biológica.
- Ela permite o controle preciso dos níveis de oxigênio em condições experimentais.
- Os achados contribuem para a compreensão do impacto da hipóxia no desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de condições hipóxicas precisas e reprodutíveis é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos em modelos de doenças onde a tensão de oxigênio influencia a atividade de vias metabólicas. Este método permite a geração escalonável e de baixo custo de ambientes definidos de O2 para apoiar triagens mecanicistas e ensaios fenotípicos em sistemas geneticamente manipuláveis. Ao reduzir a variabilidade na exposição à hipóxia, melhora-se a confiabilidade preditiva em fluxos de trabalho iniciais de descoberta direcionados a vias sensíveis à hipóxia.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de respostas transcripcionais dependentes de HIF-1 sob concentrações controladas de O2 para validar alvos sensíveis à hipóxia.
- Valor Operacional: Permite coletas rápidas após exposição à hipóxia para capturar alterações sinalizadoras transitórias antes de sua reversão.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece condições quantitativas e reproduzíveis definidas por O2 para triagem de compostos que modulam vias de resposta à hipóxia.
- Valor Operacional: A transparência da câmara permite a visualização em tempo real de respostas fenotípicas durante a exposição ao gás.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a modelagem de resposta à dose de níveis de O2 para mapear os efeitos dependentes da concentração no desenvolvimento e na sobrevivência.
- Valor Operacional: Adaptável a outros sistemas modelo e gases (por exemplo, CO2, H2S) para modelagem fisiopatológica mais ampla.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese do alvo até a validação do ensaio, particularmente para vias moduladas pela disponibilidade de oxigênio.
- Biologia da Descoberta: Permite controle preciso de O2 para isolar efeitos dependentes de HIF-1 em estudos de validação genética.
- Triagem: Gera condições hipóxicas estáveis e equilibradas, adequadas para triagem de compostos com alta reprodutibilidade.
- Análises: Apoia ensaios downstream de viabilidade, expressão transcricional ou proteica após intervalos hipóxicos definidos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a concentração de O2 com resultados fenotípicos relevantes para isquemia, microambiente tumoral ou distúrbios do desenvolvimento.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: O design modular permite adaptação entre laboratórios e sistemas modelo sem a necessidade de revalidar os princípios básicos de fornecimento de gás.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao permitir experimentos com titulação precisa de O2 em modelos geneticamente passíveis de modificação.
- Valor Operacional: Configuração de baixo custo e fácil fabricação aumenta a acessibilidade e a padronização entre grupos de pesquisa.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao fornecer dados confiáveis sobre a modulação de alvos em níveis de O2 fisiopatologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos que atuam sobre hipóxia, por meio de leituras fenotípicas reproduzíveis.
Considerações sobre a Implementação
- Exige conhecimento básico em manipulação de gases e acesso a cilindros de O2/N2 comprimidos com concentrações certificadas.
- Depende de instrumentação para controle de fluxo (por exemplo, controladores de fluxo de massa) e materiais para fabricação de câmaras estanques a gás.
- Necessita de POPs padronizados para vedação da câmara, umidificação do gás e carregamento da amostra, a fim de garantir reprodutibilidade.
- Deve levar em conta as faixas de tolerância ao O2 específicas do modelo ao realizar traduções entre espécies ou tipos celulares.
- É limitado pelo volume da câmara e pelas dinâmicas de fluxo, o que pode afetar o tempo de equilibração em formatos de alto rendimento.
