ДНК-микрочипов: Контроль качества образцов, Array Гибридизация и сканирования

Общая цель данной процедуры — проведение эксперимента с использованием микрочипов с помощью автоматического смесительного аппарата. Для этого сначала анализируют качество образцов РНК с помощью биоанализатора после амплификации и мечения РНК. Затем образцы РНК гибридизируют с микрочипами.

Наконец, гибридизированные микрочипы промывают и сканируют. В итоге получаются результаты, демонстрирующие дифференциальную экспрессию РНК-транскриптов посредством анализа двухцветных флуоресцентных изображений микрочипов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы гибридизации микрочипов трудно освоить из-за использования специализированного оборудования.

Анализ контроля качества начинается с подготовки биоанализатора 2100 и станции прайминга чипа в соответствии с письменной инструкцией. Затем гель-матрицу фильтруют, перенося 550 µL в центрифужный фильтр, входящий в состав набора RNA 6000 Nano. Фильтрацию проводят при 1,500 RCF в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем разлейте отфильтрованный гель по аликвотам объемом 65 µL, которые можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца. Перемешайте концентрат красителя на вортексе в течение 10 секунд и добавьте 1 µL в аликвоту объемом 65 µL. После перемешивания отфильтрованного геля центрифугируйте смесь при 13 000 RCF в течение 10 минут при комнатной температуре перед нанесением образцов.

Сначала установите чип на станцию праймирования. В данной демонстрации используются чипы RNA 6, 000 nano. Внесите 9 µL смеси красителя для геля в лунку, отмеченную белой буквой G на черном фоне.

Расположите наконечник пипетки у самого дна лунки. Установите поршень шприца на отметке 1 mL и закройте станцию для заполнения. Медленно, но уверенно надавите на поршень до тех пор, пока он не будет зафиксирован зажимом.

Через 30 секунд отпустите зажим и подождите несколько секунд, пока плунжер поднимется. Когда плунжер остановится, потяните его обратно до отметки 1 мл и откройте станцию заполнения. Наберите 9 µL гелевого красителя.

Перемешайте содержимое в каждой из двух лунок. Маркер G. Затем внесите по 5 µL маркера в лунку для маркера молекулярной массы и в каждую из 12 лунок для образцов. Далее внесите 1 µL денатурированного маркера в лунку для маркера и по 1 µL каждого денатурированного образца в соответствующие лунки для образцов.

Наконец, добавьте по одному микролитру маркера в каждую неиспользуемую лунку образца. После заполнения провortexируйте чип в течение одной минуты при 2 400 RPM. После запуска программного обеспечения 2 100 expert установите чип и закройте крышку.

Убедитесь, что выбран правильный порт, и запустите анализ в течение пяти минут после загрузки образцов, чтобы предотвратить испарение. Методы проведения амплификации и мечения РНК приведены в письменном протоколе. После мечения очистите cRNA для удаления невключенных нуклеотидов с помощью колонок cogens r n easy mini; затем количество меченой cRNA можно определить с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000.

В режиме измерения на микрочипе запишите концентрацию образца, выход и удельную активность. Для гибридизации на микрочипе необходимо обеспечить выход не менее 825 нанограмм и удельную активность не менее восьми пикомолей на микрограмм минимум за два часа до начала гибридизации на микрочипе. Включите станцию гибридизации и установите температуру 65 °C.

В данном протоколе описывается использование массивов Agilent 4x40 4K с системой гибридизации Roche NimbleGen и четырьмя камерами смесителей. После фрагментации cRNA, проведенной согласно письменному протоколу, подготовьте гибридизационную камеру. Поместите предметное стекло с микрочипом в инструмент для сборки и разборки штрих-кодом вниз. Сначала откройте смеситель A и зафиксируйте массив и инструмент для сборки и разборки с помощью адгезива, чтобы предотвратить любое смещение.

Разместите смеситель A four на предметном стекле, начиная с дальнего конца. Убедитесь, что он правильно совмещен с инструментом, и зафиксируйте смеситель вдоль матрицы. Потяните за край смесителя, чтобы извлечь узел «предметное стекло — смеситель».

С помощью инструмента для разглаживания (брейера) прижмите всю поверхность клейкой прокладки, чтобы она плотно приклеилась к предметному стеклу. На темном фоне могут быть видны маленькие пузырьки воздуха, попавшие между клеем и стеклом. Потратьте дополнительное время, чтобы удалить эти пузырьки с помощью брейера.

Теперь массив готов к загрузке. С помощью дозатора с положительным вытеснением наберите 100 µL образца для гибридизации. Плотно вставьте наконечник в загрузочное отверстие и медленно и плавно внесите образец, чтобы в области массива не образовались пузырьки воздуха.

Когда образец покроет весь массив и жидкость начнет выходить из вентиляционного отверстия, быстро извлеките пипетку, предварительно отпустив plunger. Как только наконечник будет удален от предметного стекла, осторожно промокните излишки жидкости в обоих отверстиях, стараясь не вытянуть образец из самой камеры. Затем с помощью пинцета заклейте отверстия стикерами.

Поместите предметное стекло в станцию для гибридизации и убедитесь, что отверстия в мембране правильно расположены над уплотнительными кольцами. Это обеспечит надлежащее перемешивание в процессе гибридизации. Закройте крышку для стекла и крышку станции.

Переведите станцию в режим смешивания B и проведите гибридизацию микрочипа при 65 °C в течение 17 часов. По завершении наполните стеклянную кювету с маркировкой A первым промывочным буфером; кювета должна быть достаточно большой, чтобы в ней мог поместиться инструмент для сборки/разборки и оставалось место для манипуляций. Все промывки следует проводить в стеклянной посуде, так как пластик может выделять соединения, что приводит к высокому фоновому сигналу на микрочипе.

Поместите кассету для предметных стекол и магнитный перемешиватель в кювету для окрашивания. Наполните кювету, помеченную буквой B, промывочным буфером 1 так, чтобы он покрывал кассету, и установите кювету на магнитную мешалку при комнатной температуре. Также поместите магнитный перемешиватель в пустую кювету для окрашивания, помеченную буквой C, и установите ее на магнитную мешалку.

Извлеките массив из станции гибридизации и поместите его в инструмент для сборки и разборки. Погрузите всю конструкцию в чашку, удерживая инструмент для сборки и разборки и предметное стекло противоположными сторонами одной рукой. Осторожно отделите смеситель A4, стараясь не поцарапать область массива.

Быстро поместите предметное стекло на штатив и в чашку для окрашивания B. Воздействие воздуха следует свести к минимуму, так как краситель SCI five чувствителен к озону. Промойте в течение одной минуты, перемешивая на средней скорости. Наполните чашку для окрашивания C предварительно нагретым промывочным буфером two.

Перенесите предметные стекла и промойте их в течение одной минуты. После промывки очень медленно извлеките кассету со стеклами из емкости для окрашивания C, чтобы минимизировать количество капель, остающихся на стекле. Высушите стекло в центрифуге в течение двух минут.

Затем поместите предметное стекло в коническую пробирку объемом 50 milliliter и заполните её аргоном, после чего немедленно проведите сканирование с помощью сканера GenePix 4,000B от Molecular Devices, чтобы избежать потери сигнала, как показано на видео. Здесь представлены примеры четырех образцов РНК, выделенных из головного мозга человека. Качество образцов опухолевой ткани оценивали с помощью биоанализатора 2,100 с использованием чипа RNA 6,000.

Закрашенные и открытые наконечники стрелок указывают на положение видов 18 s и 28 S-R-R-N-A соответственно. Число целостности РНК или RIN представляет собой количественную меру качества РНК. Образцы тотальной РНК хорошего качества при анализе на биоанализаторе для контроля качества должны давать только два основных пика, соответствующих двум основным видам рибосомальной РНК.

Некоторая деградация РНК будет проявляться в виде шлейфа перед первым пиком рибосомной РНК, а в случае сильной деградации пик 28 S-R-R-N-A будет значительно ниже. РНК низкого качества будет характеризоваться широким пиком или серией пиков при низком времени удерживания. При этом два пика рибосомной РНК будут иметь очень низкую интенсивность или вообще не будут идентифицированы.

Массивы высокого качества должны обеспечивать высокий сигнал при относительно низких значениях ФЭУ. Ожидается, что большинство транскриптов будут присутствовать на схожих уровнях в экспериментальном и контрольном образцах. Масштабные повсеместные изменения в экспрессии генов, вероятно, не будут иметь биологического значения.

Следовательно, большая часть матрицы должна выглядеть желтой, а не зеленой или красной. Сигналы хорошего качества также должны находиться в таком динамическом диапазоне, чтобы гистограммы сигналов полностью перекрывались, как показано на диаграмме рассеяния изображения матрицы. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить эксперимент с использованием микрочипов с помощью автоматизированного аппарата для гибридизации.