Анализ легких созревание дендритных клеток и миграции в течение аллергического воспаления дыхательных путей

Целью данной процедуры является оценка созревания и миграции дендритных клеток (ДК) легких в ходе индуцированного Val Boomin аллергического воспаления дыхательных путей у мышей. Это достигается путем предварительной сенсибилизации мышей препаратом Val Boomin с последующим воздействием на дыхательные пути Val Boomin, меченным fitsy. Затем проводят забор легких и медиастинальных лимфатических узлов.

Наконец, из тканей легкого и лимфатических узлов готовят суспензию одиночных клеток. В итоге с помощью проточной цитометрии можно оценить статус созревания и абсолютное количество дендритных клеток в средостениальных лимфатических узлах после введения FITC Val Boomin. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о pulmonary иммунном ответе, такие как подвергаются ли дендритные клетки созреванию при воздействии антигена и мигрируют ли они в дренирующие лимфатические узлы.

А если они мигрируют, то какова скорость этой миграции. Начните с по капельного добавления свежеприготовленного раствора Val Boomin в соотношении один к одному в пробирку с алюминием при перемешивании на вортексе. Перемешивайте смесь в течение 30 минут, затем наберите в шприц объемом 1 мл 0,2 мл смеси.

Удерживая мышь одной рукой за загривок в области основания черепа, используя большой и указательный пальцы, другой рукой введите раствор алюминия Val Boomin в брюшную полость мыши. Через семь дней после второй инъекции Val в алюминии удерживайте анестезированное животное, сенсибилизированное к Val в алюминии, в вертикальном положении, затем с помощью стерильных наконечников для пипеток по капельно нанесите 100 µL свежеприготовленного раствора val в fxi на NAS мыши.

Начните с закрепления катетера 20-го калибра на шприце объемом 1 мл. Затем, после подтверждения эвтаназии мыши, вскройте грудную полость животного до самого основания шеи, чтобы обнажить трахею мыши и установить в нее канюлю. Крайне важно провести промывание легких и перфузию сердца, чтобы убедиться, что все загрязняющие альвеолярные макрофаги и мононуклеарные клетки, присутствующие в периферической крови, были удалены.

Следующие два этапа следует выполнять предельно осторожно и, разумеется, твердой рукой. Теперь трижды введите ледяной PBS с EDTA через катетер, чтобы промыть нижние дыхательные пути и удалить клетки из альвеолярных пространств. Затем, оснастив шприц объемом 10 мл иглой 20G, проведите перфузию легких 10 мл PBS с гепарином через правый желудочек сердца.

Удаление всех оставшихся клеток крови из сосудов легких считается завершенным, когда легкие становятся белыми. Затем удалите медиастинальные лимфатические узлы, поместив их в отдельную чашку. Чтобы предотвратить гашение флуоресценции, минимизируйте воздействие света на ткани.

Затем препарируйте перфузированные легкие, перенесите их в чашку Петри и измельчите с помощью ножниц. Далее подвергните ткань легких ферментативному расщеплению при 37 °C в растворе коллагеназы D в концентрации 250 units/mL. После 25 минут инкубации добавьте в смесь ЭДТА на пять минут, чтобы остановить активность коллагеназы. В завершение пропустите фрагменты расщепленных легких через клеточный фильтр с размером пор 100 µm и проведите лизис эритроцитов с помощью гипотонического буфера.

Аккуратно отделите средостенные лимфатические узлы с помощью тонких игл и подвергните их воздействию коллагеназы, как было продемонстрировано ранее для легких, после чего профильтруйте ткань через клеточный фильтр после внутрибрюшинного введения, сенсибилизации и воздействия антигена на дыхательные пути. Наличие воспалительных клеток можно оценить с помощью окрашивания гематоксилином и эозином на репрезентативных срезах легких контрольной группы.

У животных, получавших физиологический раствор, в тканях отсутствует воспаление, что показано на верхнем изображении. Напротив, в срезах легких животных, сенсибилизированных и подвергнутых повторному введению антигена, наблюдается повсеместное присутствие воспалительных клеток, что видно на нижнем изображении. Для оценки выработки слизи может быть использовано окрашивание периодической кислотой-Шиффом, как показано на этом нижнем изображении.

Индукция аллергического воспаления дыхательных путей после повторного введения валенсина (val in challenge) у сенсибилизированных мышей подтверждается наличием слизи. Напротив, у контрольных мышей, получавших физиологический раствор, наблюдается полное отсутствие продукции слизи, как показано на верхнем графике; после повторного введения валенсина легочные DCs проходят процесс созревания и последующую миграцию в дренирующие лимфатические узлы.

Здесь на примере репрезентативного анализа средопозвоночных лимфатических узлов мыши показано, что у животных, сенсибилизированных и подвергнутых воздействию Val Boomin, обнаруживается умеренное, но стабильное увеличение доли CD 11 C положительных клеток по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Более того, анализ абсолютного количества CD 11 C положительных, CD 11 B положительных и Val Boomin fits C положительных клеток в средопозвоночных лимфатических узлах сенсибилизированных и подвергнутых воздействию мышей показывает, что у животных, подвергнутых воздействию, наблюдается многократное увеличение числа DC по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор. После просмотра этого видео у нас должно сложиться четкое представление о методе анализа созревания и миграции дендритных клеток легких.

Освоив данную методику, вы сможете модифицировать ее для оценки реакций дендритных клеток легких на другие патогены, а также на иные экспериментальные факторы.