FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerin veya S yüzeylerini biyoaktif konstrüktlerle zararsız ve hızlı bir şekilde işaretlemektir. Bu işlem, öncelikle fonksiyonel bir ara boşluk, lipid veya FSL konstrükt çözeltisi hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, konstrükt çözeltisinin eşit bir kısmı, hücrelerin veya VIR'lerin çözeltisinin eşit bir kısmıyla karıştırılır.

Üçüncü adım olarak, karışım 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edilir. Son adım, modifiye edilmiş hücrelerin veya sitlerin ya da modifiye edilmiş VIR'lerin veya VIR'lerin yıkanması ve her zamanki gibi deneysel olarak kullanılmasıdır. Sonuç olarak, yüzeyi modifiye edilmiş canlı hücreler veya S; akış sitometrisi, mikroskopi ve aglütinasyon dahil tüm rutin deneysel analiz teknikleri aracılığıyla görselleştirilebilir.

Bu tekniğin kovalent etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı; hızlı, dayanıklı, esnek olması ve modifiye edilen hücrenin veya varyanın canlılığını etkilememesidir. FSL konstrükt stok çözeltisini hazırlamak için öncelikle, kuru FSL ürününü yeniden çözmek amacıyla ürün şişesine bir mililitre seyreltici ekleyerek mililitre başına bir miligramlık bir stok çözelti hazırlayın. Şişeyi 30 saniye boyunca sonikleyin, stoğu 100 mikrolitrelik steril kaplara paylaştırın ve kapları iki ila sekiz santigrat derece arasında bir hafta kadar saklayın.

Kullanımdan hemen önce ekleme işlemi için çalışmaya hazır FSL konstrükt çözeltilerini hazırlamak amacıyla, topaklanmış hücreleri homojenize etmek için çözeltiyi tekrar 30 saniye boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun ve ardından FSL konstrüktünü ve tamponu gerekli konsantrasyona seyreltin. Çalışma çözeltisini iki ila sekiz santigrat derece sıcaklıkta bir haftaya kadar saklayın. Lipid içermeyen besiyerinde veya PBS içinde yeniden süspansiyon sonrası, bağlanmamış lipidlerden arındırılmış FSL modifikasyonu için hücreleri santrifüjleyin. Ardından hücreleri 100 mikrolitre dilüen içinde paketleyin; kontroller için hücreleri aynı koşullar altında 100 mikrolitre modifiye edilmemiş hücreye kadar yıkayın.

İstenirse, uygun bir dilüsyonda 100 µL FSL çözeltisi ekleyin. Buna paralel olarak, ilgisiz FSL çözeltileri ve/veya PBS ile negatif kontroller de oluşturun. Ardından, inkübasyonun ardından tüm hücre alt kümelerini 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Serbest FSL konstrüktlarını uzaklaştırmak için tüm hücreleri lipid içermeyen besiyeri veya PBS ile iki kez yıkayın ve lipid içermeyen besiyeri içinde uygun bir süspansiyon hazırlayın. FSL modifikasyon işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler dört ila sekiz derece santigrat sıcaklıkta saklanabilir. FSL konstrüktları; çeşitli biyolojik fonksiyonel gruplar olabilen fonksiyonel başlık veya F dahil olmak üzere üç ana bileşenden oluşur.

Fonksiyonel baş kısmının membrandan uzaklaşarak boşluk oluşturmasını sağlamak, su dağılımını iyileştirmek, insan serumu ve DAL lipidi ile reaksiyona girmemek için tasarlanan ara parçalı RS, konstrüktun yüzeylere kendiliğinden dahil olmasını sağlar. Temsili FSL grupları sonraki beş görüntüde gösterilmiştir. Canlı fare embriyoları, serumsuz hücre kültürü ortamında 37 °C'de 2 saatlik yöntemle FSL fluorescein ile doğrudan işaretlenmiş, yıkanmış ve ardından floresan mikroskobu altında incelenmiştir.

Bu ilk görüntüde, zop palita içermeyen, iki hücreli bir aynalı embriyo görülmektedir. Embriyonun ortasındaki yoğun boyama, klasik bir polar cisim boyamasını temsil etmektedir. Sonraki iki görüntüde, mikroskop odak düzleminin dışında kalan hücrelerin gölgeli boyanmalarını sergileyen, zop palita içermeyen dört hücreli ve sekiz hücreli aynalı embriyolar gösterilmektedir.

Bu son görüntüde, zop palita içermeyen 16 hücreli bir aynalama embriyosu gösterilmektedir. FSL floresein ile işaretlenmiş canlı aynalama embriyolarının; hem embriyo hem de zop LUCITA ile işaretlenmiş dört ila beş günlük bütün aynalama blast embriyolarının gösterildiği sonraki görüntü serisi yer almaktadır. Zebrafish'lerin FSL floresein ile işaretlenmesi gösterilmektedir. Bu ilk görüntü, dolaşımına doğrudan FSL floresein enjekte edilmiş, döllenmeden sonra 52 saatlik bir zebrafish larvasının mikro anjiyografisidir.

Zebrafish damar sisteminin boyanması burada gözlemlenebilir. FSL floresein, heterojen zebrafish böbrek dokusu hücreleri veya ZK sitleri exvivo olarak oluşturulmuş ve ardından döllenmeden 52 saat sonraki bir alıcı zebrafish'in dolaşımına mikroenjeksiyonla verilmiştir; ZK sitlerinin in vivo gözlemleri, enjeksiyondan iki saat sonra damar sisteminin floresan altında time-lapse mikroskopi ile görüntülenmesiyle yapılmıştır. Görüntüde, turuncu oklarla belirtilen büyük, yavaş hareket eden veya hareketsiz hücreler ile hareketleri nedeniyle bulanık görünen ve yeşil oklarla belirtilen hızlı hareket eden hücrelerin yer aldığı tek bir video karesi gösterilmektedir. Bu görüntüde, zebrafish embriyolarının beş güne kadar FSL floresein içeren medyuma daldırılmasıyla gerçekleştirilen konstrüktün oral alımıyla sağlanan FSL floresein etiketlemesi gösterilmektedir.

Soldaki FSL floresein ile işlem görmüş zebra balığının aydınlık alan mikroskopisi, sağdaki bitişik floresan görüntüye karşılık gelmektedir. Floresans tercihen bağırsak kanalında yerleşmiştir. Burada gösterilen işlem görmemiş kontrol embriyolarında herhangi bir boyama gözlemlenmemiştir.

Burada, veziküler stomatit virüsü veya VSV'nin, 37 °C'de iki saat boyunca 10 µg/mL FSL floresein ile doğrudan etiketlenmesi, ardından %4 paraformaldehit ile fiksasyonu ve sonrasında konfokal tarama ile analizi gösterilmiştir; VSV virionlarının saflaştırılmasına gerek duyulmamıştır. FSL etiketlemesi sonrası işlem gerekli olmuştur. Bu histogram, FSL floresein ile etiketlenmiş insan A Puerto Rico 8 19 34 veya H1N1 virüsleri ile enfekte edilmiş domuz testis hücrelerini göstermektedir.

Floresan yaymayan enfekte olmamış hücreler siyah çizgiyle temsil edilirken, domuz hücreleri ile H1N1 koronavirüsün füzyonu sonucu oluşan floresans kırmızı çizgiyle belirtilmiştir. Sonraki görüntü serisinde hücreler önce 37 °C'de bir saat boyunca FSL biotin ile işaretlenmiş, ardından yıkanmış ve Flor4 işaretli avadon ile reaksiyona sokulmuş, sonrasında ise yıkanarak floresans mikroskopisi için ıslak montaj yöntemiyle hazırlanmıştır. İlk görüntü, bir fare embriyosu blastosistinin birleştirilmiş konfokal görüntüsünü göstermekte olup, bu şekil önceki görüntüdeki embriyonun merkezi bir konfokal kesitini sunmaktadır.

Buradakiler canlı ve hareketli insan sperm zoalarıdır. Bulanıklık, hareketlerinin bir sonucudur. %4 Paraform aldehit ile fikse edilmiş insan spermatozoalarının daha net bir temsilci görüntüsü buradaki bu şekilde görülebilir.

FSL biotin ile işaretlenmiş insan eritrositlerinin %4 paraformaldehit ile fiksasyonunun, aşağıdaki iki şekilde gösterildiği üzere FSL işaretlemesini etkilemediği görülmektedir; burada, %4 paraformaldehit ile fikse edilmiş RL 95 endometrial insan karsinoma hücreleri gözlemlenebilir. Diğer görselde ise RL 95 endometrial insan karsinoma hücreleri fikse edilmemiştir. Fiksasyon yapılan ve yapılmayan iki görüntü arasında işaretleme açısından neredeyse hiç fark gözlemlenmemektedir.

İntravenöz infüzyondan iki saat sonra alınan bir kan örneğinde gözlemlenen FSL biotin işaretli RBC sitleri burada solda gösterilmiştir; hücreler sağda ışık mikroskobu altında incelenmiş, aynı hücre alanı floresan altında görüntülenmiş ve mevcut iki sit yeşil renkte tanımlanabilmiştir. Sitlerin işaretlenmemiş hücrelere oranının hesaplanması, sağkalım göstergesi olarak kullanılabilir. Bu son FSL biotin işaretli hücre görüntüsü, avidin boncuklara bağlanarak görselleştirilen canlı insan endometrial biotin sitlerini göstermektedir.

Bu son görüntü serisi, FSL konstrüktlerinin kan grubu belirteçleri ile etkileşimlerini göstermektedir. İlk görüntü, insan serum dilüsyonlarına karşı test edilen ve 500 microgram per milliliter konsantrasyonda FSLG ile kaplanmış insan eritrosit GLI sitlerini içermektedir. İnsan eritrositleri doğal olarak Xena antijeni GALI antijeni ile reaksiyona girmezler.

Bu sayede, serumdaki antikor seviyelerini miktarlandırmak için cytes kullanılabilir. Bu örnekte, azalan FSL seviyelerine sahip cytes oluşturularak hastanın antijen titresinin 1:32 olduğu belirlenmiştir. Bir antijen titresi oluşturmaya benzer şekilde, antikoru saptamak için optimal antijen seviyesi belirlenebilir ve hücreler, yalnızca antikor seviyesi belirli bir titre değerini aştığında pozitif sonuç verecek şekilde oluşturulabilir.

Pozitif sonuç almak için gereken FSL antijen seviyesi, saptanan antikorun kalitesine ve seviyesine bağlıdır. Karbonhidrat antijenleri için tipik olarak, 100 micrograms per milliliter konsantrasyonundaki bir FSL çözeltisi güçlü bir pozitif reaksiyonla sonuçlanır. Belirli bir antijen seviyesine sahip olacak şekilde modifiye edilmiş veya standartlaştırılmış olarak adlandırılan insan grup O eritrositleri.

A hücreleri, insan serumundaki antia miktarını doğru ve tekrarlanabilir şekilde belirlemek için kullanılır. Bu örnekte, hücreler donörün kendi kırmızı hücrelerinden hazırlanmış ve test edilen O grubu serumundaki antia seviyesinin 1/32 olduğu bulunmuştur. Burada altıncı tüpte, tek bir O grubu kırmızı hücre örneğine eş zamanlı olarak eklenen kan grubu A ve B antijenleri ile zayıf A, zayıf B hücreleri oluşturulmuştur.

Bu sitler, VO kalite kontrol amaçları için kullanılabilir. Özel olarak formüle edilmiş A haftası ve B haftası sitlerinin anti-A ve anti-B reaktiflerine karşı yapılan analizleri, tüplerin orta alt bölgesinde meydana gelen reaksiyonlarla bu şekilde kanıtlandığı üzere, beklenen zayıf reaksiyonları vermektedir. Bu basit teknik, doğru şekilde uygulandığında iki saat içinde tamamlanabilir.