Elektronik Burun kullanarak Meyve Uçucu Analizi

Bu prosedürün genel amacı, meyvelerdeki uçucu bileşiklerin hızlı bir analizini gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle meyve dokusunun kesilip homojenize edilmesiyle sağlanır. Ardından, sıvı numunenin üzerindeki buhar fazı elektronik burun ile analiz edilir.

Elektronik burun analizinin ardından, veriler dışa aktarılır ve dönüştürülür. Prosedürün son adımı, grafik arayüzünü kullanarak covas indeks pencerelerini belirlemek ve pikleri tek bir covas indeks etiketi altında birleştirmektir. Sonuçlar, elektronik burun ile ölçülen meyve foliküllerindeki bolluk farklılıklarının; meyve çeşidi, olgunluk ve depolama gibi deneysel işlemlerle ilişkilendirilebileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin, geleneksel gaz kromatografisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, meyvelerdeki uçucu bileşiklerin daha hızlı analiz edilmesine olanak tanımasıdır. Bu analiz gerçekleştirilirken, analit tutunma sürelerinde hafif değişiklikler meydana gelebilir. Pik hizalama süreci dikkatle değerlendirilmediği takdirde, bu durum verilerin yanlış yorumlanmasına yol açabilir.

Meyveler istenen olgunluk aşamasında hasat edildikten sonra musluk suyu ile durulayın. Kir ve tozu gidermek için analiz edilecek meyveleri seçin. Dış ve iç kusurların yokluğuna ve boyuta dayalı olarak, homojenlik sağlamak amacıyla meyveleri uçucu madde örneklemesinde kullanılacak şekilde boylamasına dilimler halinde kesin.

Eğer mevcutsa, deri çekirdeklerini, çekirdek boşluğu dokusunu veya meyve çekirdeğini çıkarın. Doku seçimi deney boyunca tutarlı olmalı ve tek bir meyve içindeki değişkenlik dikkate alınmalıdır. Örneğin, örnekler ekvatoral çiçek ve sap ucu kısımlarından eşit miktarda alınmalıdır.

Seçilen meyve dokusunu birleştirin, randomize etmek için karıştırın ve ardından 200 gramını ticari bir blendera tartarak ekleyin. 200 mililitre doygun kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Kalsiyum klorürün, meyve etinin kesilmesi ve homojenize edilmesinden sonra meydana gelebilecek enzimatik aktiviteyi inhibe etmesi amaçlanmaktadır.

Ardından, metanoldeki 100 millimolar iki metil bütil izoat çözeltisinden 50 µL ekleyin. Bu çözelti, homojenizasyon işlemi sırasında uçucu bileşiklerde meydana gelebilecek olası kayıpları izlemek için internal standart olarak eklenir. Sonrasında, karışımı bir laboratuvar blenderında 18,000 RPM hızında 30 saniye boyunca homojenize edin.

Ardından hemen bir cam şişeye dökün ve Teflon kapakla kapatın. Tüm örnekler hazırlanana kadar homojenatı şişede tutun. Köpüksüz meyve suyundan beş mililitrelik alikotları, örnek başına en az üç vial hazırlayacak şekilde 20 mililitrelik amber cam viallere pipetleyin.

Teknik tekrarlar olarak hizmet etmeleri için. Flakonları, Teflon silikon septalı çelik vidalı kapaklarla kapatın. Bu aşamada, örnekler hemen analiz edilebilir veya sıvı azot ile şok dondurularak daha sonraki analizler için ultra düşük sıcaklıkta saklanabilir.

Uygun analiz yöntemini Xenos'a yükleyin. Yazılı protokolte yer alan parametreleri girin. Xenos girişine, ucu çekirdekleme yapmayan paslanmaz çelik bir iğne bağlayın.

Baz çizgi stabilize olana ve 200 sayımın üzerinde pik tespit edilmeyene kadar sistemi ortam havasıyla birkaç kez temizleyin. Basıncı tahliye etmek için düz zincirli acas çözeltisi içeren bir flakonun septuma bir iğne batırarak cihazı ayarlamaya hazırlanın. Ardından, cihaza bağlı olan giriş iğnesini septuma yerleştirin.

Headspace örneklemesini başlatarak kalibrasyonu (tune) gerçekleştirin. Kalibrasyon sonucu, bahsedilen piklerin alıkonma sürelerini zaman birimlerinden covas indeksine veya KI birimlerine dönüştürmek için cihaz yazılımı tarafından kullanılır. Sonuç olarak, sistem kalibre edildikten sonra alıkonma süreleri KI birimleri cinsinden raporlanır.

Numune şişesinin septuma iğnelerin yerleştirilmesiyle numunenin 30 dakika boyunca dengelenmesini takiben numune analizine başlayın. Düz zincirli aca çözeltisi için yapıldığı gibi. Oynat düğmesine tıklayarak baş boşluğu numunesi almayı manuel olarak başlatın; bu işlem pompayı aktive ederek numunenin üzerinde bulunan buharları çekecektir.

Analiz sonunda ekranda bir kromatogram belirir ve sensör, temizlenmesi için otomatik olarak 10 saniye boyunca 150 °C'ye ısıtılır. Sistem durum kutusu tekrar yeşile döndüğünde, cihaz başka bir örneği analiz etmeye hazır hale gelir. Stabil bir baz hattı ve düzgün bir sistem temizliği sağlamak için her örnek arasında en az bir hava boşluğu (air blank) çalıştırın.

Örnek başına en az üç teknik tekrarın yanı sıra flakon boşluklarını analiz edin. Verileri, Mense yazılımındaki log stored data fonksiyonunu kullanarak kazanım sonrası bir Microsoft Excel dosyasına aktarın. Veriler aktarıldıktan sonra, değişkenler ve tekrarlar için etiketler içeren sütunlar ekleyin.

Cihaz yazılımından dışa aktarılan veri formatı, bu laboratuvar tarafından oluşturulan Python 0.6 betiği kullanılarak daha kolay manipülasyon için dönüştürülebilir. Giriş verileri için kaynak dosya adı ve sayfa adı ile çıktı için istenen dosya adı doğrudan betik içerisinde düzenlenir. Bu betik, tüm örnekler genelindeki benzersiz ki'lerin tanımlanması yoluyla veri manipülasyonunu ve analizini kolaylaştırır.

Veriler, satırlarda örnek bilgileri ve sütunlarda benzersiz KIS olacak şekilde yeniden düzenlenir; her hücre ilgili pik alanını temsil eder. Bir örnekte belirli bir KI değeri için pik tespit edilmezse, ilgili hücre boş kalır. Ardından, bu laboratuvar içe aktarımı tarafından oluşturulan ikinci bir betik kullanılarak, önceki adımda düzenlenen dosyadaki veriler işlenir.

Analiz, her bir KI değerinin kaç kez tespit edildiğinin izlenmesine ve analiz edilmesine dayanmaktadır. Bu nedenle program, KI vuruşlarının bir sütun grafiğini görüntüler. Her bir KI değeri için, teknik tekrarların her bir grubunu birlikte analiz ederek, örneklerin belirli alt kümelerine ait K vuruşlarını değerlendirin.

Bunu yapmak için, ilgili kutucukları işaretleyerek veya işaretlemeden her bir işlemi veya değişkeni ayrı ayrı analiz edin. Grafik arayüzünü kullanarak her bir KI penceresinin genişliğini belirledikten sonra, ilgili kromatogramlardan bazılarını rastgele seçin. Teknik tekrarlar arasındaki örtüşen pikleri mense yazılımında değerlendirin.

KI penceresi belirlendikten sonra, grafik arayüzdeki birleştirme (merge) özelliği, pencere içine düşen KIS'leri en yoğun nüfuslu ki ile birleştirmek için kullanılır. Özelliği etkinleştirmek için birleştirme düğmesine tıklayın ve pencerenin merkezindeki en yoğun nüfuslu ki'yi ilgili çubuğa sol tıklayarak seçin. Çubuk seçildiğinde rengi yeşile döner; pencere içine düşen KIS'leri seçilen ki ile birleştirmek için ilgili çubukların üzerine sağ tıklayın.

Bu işlem, çubukların kırmızıya dönmesine neden olurken, merkezdeki ki'nin üzerine karşılık gelen uzunlukta mavi bir çubuk eklenir. Seçilen tüm ki'ler uygun merkez ki ile birleştirildiğinde, değişiklikleri onaylamak için birleştirme düğmesine tekrar tıklayın. Bu, hata yapılması durumunda birleştirme düğmesinin sarıya dönmesini sağlar.

Birleştirilmiş hücreleri ayırmak için ayırma düğmesi de mevcuttur. Grafik arayüzündeki ayırma düğmesine tıklayın. Ardından, ayrılacak olan kırmızı çubuğun üzerine sağ tıklayın.

Çubuk kırmızıdan maviye döner. Değişiklikleri kabul etmek için birleştirme kaldırma butonuna tekrar tıklayın. Eğer tek bir örnekteki iki pik yanlışlıkla tek bir KI değerinde birleştirilmeye çalışılırsa, bir hata mesajı görüntülenir.

Tüm birleştirme işlemleri kaydedildikten ve istatistiksel analizlere geçilmeden önce, olası kontaminasyonları izlemek için hava ve flakon boş örneklerin kromatogramları analiz edilir. Piklerin ve boş örneklerin tutulma zamanları belirlendikten sonra, hava ve/veya flakon boş örneğinde tespit edilen piğin alanı, mevcut piğin alanından çıkarılır. Elektronik burun, farklı olgunluk aşamalarında hasat edilen kavun meyvelerinin uçucu profilindeki farkları tespit edebilmiştir.

Burada, erken olum aşamasındaki meyvelerden ve tam olgunlaşmış meyvelerden alınan kromatogram örnekleri gösterilmiş olup, pik alanlarındaki farklılıklar ortaya konulmuştur. Çok sayıda pik için tüm örneklerde 20 K pencereler belirlenmiştir. Varyans analizi, bu farklı kilerin arasından elektronik burun tarafından tespit edilen 14 pikin bolluğunun iki olgunluk aşaması arasında önemli ölçüde farklılık gösterdiğini ortaya koymuştur. Burada, bu kilerin her biri için erken olum aşamasındaki meyvenin pik bolluğu yeşil renkle, tam olgunlaşmış meyvenin pik bolluğu ise turuncu renkle çizilmiştir.

Bu prosedür tamamlandıktan sonra, elektronik burun geliştirildikten sonraki aşamada, bireysel piklere karşılık gelen bileşenleri tanımlamak için gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile eşleştirilmiş diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, hızlı bir analiz aracı sağlayacak ve bitki patolojisi, bitki fizyolojisi, hasat sonrası biyoloji ve gıda bilimi alanındaki araştırmacıların; meyvelerdeki uçucu bileşimdeki değişimleri olgunluk, çeşit veya depolama fonksiyonuna göre incelemelerine olanak tanıyacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, elektronik burun ile uçucu bileşiklerin nasıl hızlı bir şekilde analiz edileceği ve grafiksel arayüzümüz kullanılarak pik hizalamasının nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.