In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın

Bu prosedürün genel amacı, yüksek performanslı bir mikroskobun üzerinde gaz akışı düzeneği kullanılarak, anoksiye maruz bırakılan sea elegance embriyolarındaki hücresel alt yapı dinamiklerini görüntülemek için bir in vivo tekniğini tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle görüntüleme için uygun bir genç embriyo popülasyonu oluşturmak amacıyla genç yetişkin transgenik hayvanlardan bir örnek hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, mikro inkübasyon odasında kullanılmak üzere ince agros ped lamlar hazırlanır.

Ardından, deniz canlıları uygun şekilde anestezi altına alınır ve gaz akışına maruz kaldıklarında kurumalarını önlemek için halokarbon yağı ile kaplanır. Son olarak, anestezi altındaki hayvanların bulunduğu yuvarlak lamel, mikro inkübasyon odasına yerleştirilir. Görüntüleme işlemi sırasında, mikro inkübasyon odası üzerinden bir gaz akışı kullanılarak anoksik bir ortam oluşturmak amacıyla oda mikroskop tablasına yerleştirilir ve azot gazı ile doldurulur.

In vivo floresan mikroskopi ile birlikte kullanımı, anoksiye yanıt olarak ortaya çıkan hücre döngüsü duraklamasının yüksek çözünürlüklü, detaylı videolarının ve görüntülerinin elde edilmesine olanak tanır. Bu tekniğin indirekt immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hayvanlar belirli koşullara maruz bırakılırken hücre altı değişimlerin in vivo olarak belgelenebilmesidir. Bu yöntem, elegans embriyolarında anoksi kaynaklı süspansiyon durumuna (suspended animation) dair içgörü sağlayabilir.

Bu yöntem ayrıca maya, hücre kültürü veya diğer küçük omurgasız ya da omurgalı embriyoları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Hiperoksi sıcaklığı, stres veya küçük moleküllerle tedavi gibi ek koşullar da uygulanabilir. Bu prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan iki lisansüstü öğrencisi olan Anastacia Garcia ve Mary Latt'tır. Çalışmada ilgili uygun bir transgenik C Elgan suşu ile başlayın; bu çalışmada, hücre bölünmesi için işaretleyici olarak kromozomları ve sentrozomları görselleştirmek amacıyla TH 32 transgenik suşu kullanılacaktır.

Hipoklorit solüsyonu ile yetişkinlerin yer çekimine bağlı çökelmesini sağlayarak onları parçalayıp senkronize bir popülasyon oluşturun; kalan embriyoları kullanmak için yer çekimine bağlı çöken yetişkinleri ekili bir plakaya aktarıp bir ila iki saat yumurta bırakmalarını bekleyin veya karma bir popülasyondan L4 larvalarını yeni ekili bir plakaya aktarın. Nematodları, yumurtadan çıkıştan itibaren yaklaşık 96 saat, L1 larvalarından itibaren 72 saat veya L4 değişiminden sonra 24 saat sürecek şekilde, GR genç yetişkinlik evresine gelene kadar 20 °C'de büyütün. Bu metodoloji, hücresel altı ve çekirdek altı değişimlerin görüntülenmesi için optimal olan geniş blastomerler ve çekirdekler içeren bol miktarda genç embriyoya sahip genç yetişkinlerden oluşan bir popülasyon oluşturma imkanı sağlar.

Hazırlanan lamları muhafaza etmek için nemli bir hazne kurmak amacıyla, yeterli büyüklükte bir kapakla kapatılmış büyük bir Petri kabı veya kutunun içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin. Karışımı bir mikrodalga fırın veya benmari vasıtasıyla cam malzemeler içerisinde ısıtarak, deiyonize su içerisinde %2 aros eritilmiş çözeltisi hazırlayın. Ardından, temiz bir cam mikroskop lamı üzerine bir ila üç damla ılık aros damlatın ve hemen üzerine ikinci bir lamı ters şekilde dik olarak yerleştirip, oluşan tabakanın ince ve hava kabarcıklarından arındırılmış olması için hafifçe bastırın.

Aros yavaşça soğuduktan sonra, aros pedini lamlardan birinin üzerinde bütün halde bırakarak iki lamı birbirinden ayırın. Aros pedinin, mikroskobun odaklama yeteneğini engellemeyecek kadar ince olduğundan emin olmak önemlidir. Daha sonra, aros pedini küçük bir kare şeklinde düzeltmek için temiz bir jilet kullanın.

Kullanılana kadar hazırlanan nemli oda içerisindeki lamlar bekletilir. Aynı temiz jilet kullanılarak, aros pad'in kenarı dikkatlice alınır ve lamdan 25 milimetrelik yuvarlak bir mikro kapatma camı üzerine aktarılır. Yuvarlak kapatma camının altında hava kabarcığı birikiminden kaçınılmalı ve cam, mikro inkübatöre uygun şekilde yerleştirilmelidir.

Aros pedinin üzerine bir damla anestezik ekleyin. Beş ila 10 adet solucan seçin ve bunları anestezik damlasının içine yerleştirin. Solucanların hareketinin durması için bir ila üç dakika bekleyin.

Gaz hazne içinden akıtılırken solucanların susuz kalmasını önlemek için, bir pipet ucu yardımıyla solucanların üzerine bir damla hallow karbon yağı ekleyin. Ardından, esnek plastik borunun bir ucunu hazneye bağlayın. Kapalı perfüzyon mikro inkübatörünün iki yarısını ayırın ve lamel camını dikkatlice alt halkanın üzerine dik konumda yerleştirin.

Kameranın iki tarafını sıkıca kapatın. Ardından kamerayı, esnek plastik tüp aracılığıyla azot gaz tüpüne bağlayın ve mikroskop tablasına yerleştirin. Embriyoları görüntülemeden önce, tüpün ve kameranın yan tarafındaki port tıkaçlarının güvenli bir şekilde takılı olduğundan emin olarak herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Öncelikle, düşük büyütmede hayvanların yerini belirleyin. Ardından uygun olan daha yüksek büyütmeye geçin. Yetişkinlerde embriyonik blasphemers görüntülemek için, ilgilenilen hücrelerdeki GFP füzyon proteinini bulmak üzere 488 nanometre lazeri kullanın.

Hücre döngüsü duraksamasının belirli bir aşamasını, örneğin geç profazı görüntülemek için, geç interfaz veya erken profaz gibi hücre bölünmesinin önceki bir aşamasındaki bir blastomeri belirleyin. Hazneyi nitrojen gazı ile perfüze edin ve nitrojen hazneyi doldururken, gerektiğinde odak düzlemini ayarlayarak blastomerleri izlemeye devam edin. Bu durumda, ilgilenilen istenen fenomeni yakalamak için zaman ayarlı görüntüleme (time-lapse imaging) yapın.

Profaz durması ve kromozomların iç nükleer membrana kenetlenmesi. 30 dakikaya kadar her 10 saniyede bir görüntü alın. Tipik olarak, anoksi ile indüklenen profaz durması, azot gazı akışının başlamasından sonraki 20 ila 30 dakika içinde gerçekleşir.

Anoksi ile indüklenen duraklama durumundan geri dönüşü belgelemek için gazı kapatın ve zaman aşımı serisi kaydederken odanın normoksiye dönmesine izin verin. Hücre döngüsünün yeniden başlaması ve kromozomların çözülmesi tipik olarak beş ila 20 dakika içinde gerçekleşir. Görüntüleri ve videoları işlemek için erris image J veya Photoshop kullanın ve görüntüleme için bunları QuickTime'a aktarın.

Anoksiye maruz kalan embriyoda, profaz kromozomları yoğunlaşacak ve nükleerB periferinin iç kısmına hizalanacaktır. Yeniden oksijenasyon üzerine kromozom kenetlenmesi (chromosome docking) olarak adlandırılan bu fenomenle birlikte hücre döngüsü ilerlemesi yeniden başlayacak ve profaz kromozomları oluşacaktır.

Blasfeminin nükleer periferiden ekvatoral plağa doğru hareketi, metafaza geçişi gösterir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun evredeki hayvanlar kullanılarak üç ila dört saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, deneyi tamamlamak için yeterli zaman ayırmak adına yalnızca sağlıklı genç yetişkin hayvanlar kullanmayı ve uygun evredeki blasfemi seçimini öğrenirken sabırlı olmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek çözünürlüklü bir mikroskop altında, gaz akışlı bir hücre ve GaN embriyoları kullanarak in vivo anoksi kaynaklı hücresel alt olayların nasıl görüntüleneceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız.