ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تجربة مصفوفة دقيقة (microarray) باستخدام جهاز خلط آلي. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحليل جودة عينات RNA أولاً باستخدام المحلل الحيوي (bioanalyzer) بعد تضخيم RNA ووسمه، ثم يتم تهجين عينات RNA مع المصفوفات الدقيقة.

أخيرًا، يتم غسل المصفوفات الدقيقة المهجنة ومسحها ضوئيًا. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج تظهر التعبير التفاضلي لنسخ RNA من خلال تحليل صور المصفوفات الدقيقة ذات الفلورة ثنائية اللون. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن خطوات تهجين المصفوفات الدقيقة يصعب تعلمها بسبب المعدات المتخصصة.

يبدأ تحليل مراقبة الجودة بتجهيز جهاز bioanalyzer 2,100 ومحطة تحضير الرقاقة وفقاً للإجراءات المكتوبة. بعد ذلك، يتم ترشيح مصفوفة الهلام عن طريق سحب 550 µL ونقلها إلى مرشح طرد مركزي (spin filter) متوفر في طقم RNA 6,000 nano. يتم إجراء الطرد المركزي للمرشح عند 1,500 RCF لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم يتم تقسيم الهلام المُرشح إلى حصص بحجم 65 µL، والتي يمكن تخزينها في درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى شهر واحد. يُرجّ مركز الصبغة باستخدام جهاز Vortex لمدة 10 ثوانٍ، ثم يُضاف 1 µL منه إلى حصة بحجم 65 µL. وبعد رجّ الخليط، يتم طرد الهلام المُرشح مركزياً عند 13,000 RCF لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشغيل العينات.

أولاً، ضع الشريحة في محطة التحضير. في هذا العرض التوضيحي، يتم استخدام شرائح RNA 6,000 nano. قم بتحميل 9 µL من مزيج صبغة الهلام في البئر المميز بحرف G أبيض على خلفية سوداء.

مع وضع طرف الماصة في قاع البئر تماماً، اضبط مكبس المحقنة عند 1 mL ثم أغلق محطة التحضير. اضغط المكبس لأسفل ببطء وبثبات حتى يثبته المشبك.

بعد 30 ثانية، حرر المشبك واترك المكبس يرتفع لبضع ثوانٍ. بعد توقف المكبس، اسحبه للخلف إلى موضع 1 mL ثم افتح محطة التحضير. اسحب 9 µL من صبغة الهلام.

قم بالخلط في كل من البئرين. ضع علامة G. ثم قم بنقل 5 µL من العلامة إلى بئر السلم وإلى كل من آبار العينات الـ 12. بعد ذلك، قم بتحميل 1 µL من السلم الممسوخ في بئر السلم و 1 µL من كل عينة ممسوخة في آبار العينات.

أخيرًا، أضف 1 µL من العلامة إلى كل عينة غير مستخدمة. وبمجرد تحميل الآبار، قم برج الشريحة باستخدام جهاز الفورتكس لمدة دقيقة واحدة بسرعة 2,400 RPM. بعد تشغيل برنامج 2,100 expert، ضع الشريحة في موضعها وأغلق الغطاء.

تأكد من اختيار المنفذ الصحيح وقم بتشغيل المقايسة في غضون خمس دقائق من تحميل العينات لمنع التبخر. يمكن العثور على طرق إجراء تضخيم الـ RNA ووسمه في البروتوكول المكتوب. بمجرد الوسم، قم بتنقية الـ CRNA لإزالة أي نيوكليوتيدات غير مدمجة باستخدام أعمدة cogens r n easy mini، ثم يمكن تقدير كمية الـ CRNA الموسوم باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000.

في وضع قياس المصفوفة الدقيقة، قم بتسجيل تركيز العينة، والحصيلة، والنشاط النوعي. وبالنسبة لتهجين المصفوفة الدقيقة، من الضروري تحقيق حصيلة لا تقل عن 825 nanograms ونشاط نوعي لا يقل عن eight picomoles per microgram قبل ساعتين على الأقل من عملية تهجين المصفوفة الدقيقة. قم بتشغيل محطة التهجين واضبطها على 65 °C.

يصف هذا البروتوكول استخدام مصفوفات Agilent 4x40 4K مع نظام التهجين Roche nimble gen وغرف خلط رباعية. بعد إجراء تفتيت cRNA كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، قم بتجهيز غرفة التهجين. ضع شريحة المصفوفة الدقيقة في أداة التجميع والتفكيك بحيث يكون جانب الرمز الشريطي (barcode) للأعلى. افتح أول غرفة خلط A واكشف عن المادة اللاصقة التي تثبت المصفوفة وأداة التجميع والتفكيك لمنع حدوث أي حركة.

ضع الخلاط A four على الشريحة بدءاً من الطرف البعيد. تأكد من محاذاته بشكل صحيح مع الأداة وقم بتثبيت الخلاط على طول المصفوفة. اسحب الشريحة من طرف الخلاط لإزالة مجموعة الشريحة والخلاط.

باستخدام أداة الفرد (braying tool)، اضغط على طول الحشية اللاصقة للتأكد من التصاقها بإحكام بالشريحة. يمكن رؤية فقاعات هواء صغيرة محبوسة بين المادة اللاصقة والشريحة مقابل الخلفية الداكنة. خصص وقتاً إضافياً لإزالة هذه الفقاعات باستخدام أداة الفرد.

أصبحت المصفوفة الآن جاهزة للتحميل. استخدم ماصة الإزاحة الإيجابية لتحميل 100 µL من عينة التهجين. ادفع الطرف بإحكام داخل فتحة الدخول ثم قم بالتوزيع ببطء وسلاسة لضمان عدم انحباس الهواء في منطقة المصفوفة.

عندما تغطي العينة المصفوفة بأكملها ويبدأ السائل في الخروج من منفذ التصريف، اسحب الماصة بسرعة مع تحرير المكبس فقط. وبمجرد ابتعاد طرف الماصة عن الشريحة، جفف السائل الزائد بلطف عند كلا المنفذين، مع الحرص على عدم سحب العينة من الغرفة نفسها. بعد ذلك، قم بتغطية فتحات المنافذ بملصقات باستخدام الملقط.

ضع الشريحة في محطة التهجين وتأكد من وضع فتحات المثانة بشكل صحيح فوق الحلقات الدائرية (O rings). سيضمن ذلك الخلط المناسب أثناء عملية التهجين. أغلق غطاء الشريحة وغطاء المحطة.

اضبط المحطة على وضع الخلط B وقم بتهجين المصفوفة عند 65 درجة Celsius لمدة 17 ساعة. وبمجرد الانتهاء، املأ وعاءً زجاجياً مُسمى A بمحلول الغسل الأول، ويجب أن يكون الوعاء كبيراً بما يكفي لاستيعاب أداة التركيب والتفكيك والسماح ببعض حرية الحركة أيضاً. يجب إجراء جميع عمليات الغسل في أوانٍ زجاجية لأن البلاستيك يميل إلى تسريب مركبات تؤدي إلى ارتفاع الخلفية في المصفوفة.

ضع حامل شرائح وقضيب تحريك في وعاء تلوين. املأ الوعاء، المسمى B، بمحلول الغسل buffer one بحيث يغطي الحامل، ثم ضع الوعاء على لوح تحريك في درجة حرارة الغرفة. كذلك، أضف قضيب تحريك في وعاء تلوين فارغ مسمى C وضعه على لوح تحريك.

قم بإزالة المصفوفة من محطة التهجين ووضعها في أداة تجميع وتفكيك المصفوفات. اغمر التجميعة بأكملها في الطبق (أ) مع الإمساك بأداة التجميع والتفكيك والشريحة من الجانبين المتقابلين بيد واحدة. قم بإزالة الخلاط A4 بعناية مع الحرص على عدم خدش منطقة المصفوفة.

ضع الشريحة بسرعة على الحامل وفي وعاء التلوين B. يجب تقليل التعرض للهواء لأن صبغة SCI five حساسة للأوزون. اغسل الشريحة لمدة دقيقة واحدة مع التقليب بسرعة متوسطة. املأ وعاء التلوين C بمحلول الغسيل المنظم two الدافئ مسبقاً.

انقل الشرائح واغسلها لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسل، قم بإزالة حامل الشرائح من وعاء الصبغ C ببطء شديد لتقليل القطرات المتبقية على الشريحة. جفف الشريحة عن طريق التدوير لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، ضع الشريحة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter واملأه بغاز argon، ثم قم بعمل مسح ضوئي فوراً باستخدام ماسح gene picks 4, 000 B من شركة molecular devices لتجنب فقدان الإشارة الموضح. فيما يلي أمثلة لأربع عينات RNA تم عزلها من دماغ بشري. تم تقييم جودة عينة نسيج الورم باستخدام جهاز 2, 100 bioanalyzer على شريحة RNA 6, 000.

تشير رؤوس السهام المصمتة والمفتوحة إلى موقع أنواع 18 s و 28 S-R-R-N-A على التوالي. يُعد رقم سلامة الحمض النووي الريبوزي أو RIN قياساً كمياً لجودة RNA؛ حيث يجب أن تعطي عينات Total RNA عالية الجودة قمتين رئيسيتين فقط عند تشغيلها في جهاز bioanalyzer لضبط الجودة، بما يتوافق مع نوعي الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي الرئيسيين.

سيظهر بعض تحلل الـ RNA على شكل لطخة قبل ذروة الـ RNA الريبوسومي الأولى، وستكون الذروة الخاصة بـ 28 S-R-R-N-A أقل بكثير في حالة التحلل الشديد. أما الـ RNA منخفض الجودة فسيظهر على شكل ذروة عريضة أو سلسلة من الذروات عند أزمنة احتجاز منخفضة، بينما ستكون ذروتا الـ RNA الريبوسومي ذات كثافة منخفضة جداً أو غير قابلة للتحديد على الإطلاق.

يجب أن تنتج المصفوفات ذات الجودة العالية إشارة عالية عند قيم PMT منخفضة نسبياً. ومن المتوقع أن تكون معظم النسخ موجودة بمستويات مماثلة في كل من العينة التجريبية والعينة المرجعية. ومن المرجح أن التغيرات الواسعة والنطاق في التعبير الجيني ستكون مفتقرة إلى أي أهمية بيولوجية.

وبناءً على ذلك، يجب أن يظهر معظم المصفوفة باللون الأصفر بدلاً من الأخضر أو الأحمر. كما يجب أن تكون الإشارات ذات الجودة العالية ضمن نطاق ديناميكي بحيث تتداخل مخططات توزيع الإشارات (histograms) بشكل كامل كما هو موضح في المخطط المبعثر لصورة المصفوفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة المصفوفة الدقيقة باستخدام جهاز تهجين آلي.