利用优化的合成表面稳定肝细胞表型

本实验的总体目标是优化聚合物包被表面，以维持干细胞来源的人肝细胞的长期稳定培养。该目标的实现首先需要合成聚氨酯1 3 4（PU 1 3 4）；第二步是选择合适的溶剂以溶解PU 1 3 4。

接下来，优化在玻璃盖玻片上使用PU 1 3 4进行旋涂的过程。最后一步是优化聚合物P 1 34涂层玻璃盖玻片的灭菌程序，最终通过扫描电子显微镜、原子力显微镜和药物代谢分析，评估PU 1 34聚合物涂层对干细胞来源的肝细胞功能的影响。

与现有方法（如在培养中使用动物来源的基质）相比，该技术在维持具有肝细胞特征的多能干细胞方面的主要优势在于，这些合成材料可根据特定目的进行精细调控，并可按质量保证标准实现规模化生产。此外，它们具有批次间的一致性。该技术的应用前景涵盖肝脏疾病的治疗，因为它展示了如何优化合成聚合物表面以维持细胞表型的一个实例。

进行该实验操作的是来自我实验室的博士后 Jeffrey Walton 博士。在开始此操作之前，将一缩二乙二醇单己醚和新戊二醇在40°C下于真空烘箱中加热处理48小时，以去除任何残留的水分。将每种单体各22毫摩尔以及55毫摩尔的对苯二甲酸加入一个连接了Dean-Stark装置并装有磁力搅拌子的双颈圆底烧瓶中。

随后，将整个装置置于真空环境中，并在40摄氏度下温和加热玻璃器皿6小时，以避免在向烧瓶中添加化学品时吸收任何水分。将装置从烘箱中取出并置于氮气氛围下后，用注射器将0.0055摩尔的催化剂钛四丁氧化物逐滴加入烧瓶中。在180摄氏度下搅拌反应混合物24小时，同时在Dean-Stark陷阱中收集残留的水分。

让产物冷却至室温。接下来，将3.2毫摩尔（即1当量）的多元醇P-H-N-G-A-G与6.4毫摩尔（即2当量）的4,4'-亚甲基双(苯基异氰酸酯)溶于12毫升无水DMSO中，加入至一个连接Dean-Stark装置并配有磁力搅拌子的双颈圆底烧瓶中。

在氮气氛围下，将反应混合物于 70 摄氏度搅拌。然后通过注射器逐滴加入催化剂二氧化钛，使其终浓度为 0.8%。反应一小时后，加入一当量扩链剂 1,4-丁二醇，得到共聚物产物。将温度升至 90 摄氏度，并在氮气氛围下继续反应 24 小时。

待反应混合物冷却至室温后，将二噁烷醚逐滴加入反应混合物中，直至观察到聚氨酯产物析出沉淀。将反应混合物转移至离心管中，在5,300 × g 条件下离心5分钟。倾倒上清液后，将残留物在室温下干燥，直至溶剂完全蒸发。

取约200毫克PU 1 34，置于玻璃瓶中。用氯仿，或氯仿与甲苯以1:1比例混合的溶剂，或四氢呋喃，或四氢呋喃与氯甲烷以1:1比例混合的溶剂，将样品稀释至终浓度为2%。使用摇床，在室温下以每分钟200次的速度剧烈振荡溶液20分钟，直至溶液均匀且无沉淀物出现。

完成后，将约15毫米见方的玻璃盖玻片放置在旋转涂覆仪上。使用移液器将50微升PU1至PU4溶液滴加到盖玻片上，以23×g的离心力旋转每张盖玻片7秒。随后在室温下将盖玻片自然晾干至少24小时，再进行灭菌处理。此时，使用实验室放射源对每张聚合物包被的盖玻片进行γ射线辐照灭菌，剂量为10戈瑞，持续照射12分钟。

或者，使用30瓦紫外灯对每张聚合物包被的盖玻片两侧各照射16分钟。处理完成后，根据盖玻片尺寸将其放入合适的组织培养板中。在无血清培养基条件下，于分化过程的第9天，将经解离试剂处理的人胚胎干细胞系的解离细胞进行培养和分化，并重新接种至PU 1 34包被的盖玻片上，随后进行扫描电子显微镜观察。

不同涂层玻璃盖玻片的图像显示，使用甲苯或氯仿涂层时涂层不均匀，表现出聚醚134（PE 134）沉淀导致的不均一性。相比之下，四氢呋喃能够实现更为均匀的旋涂表面。此外，对不同聚合物涂层进行原子力显微镜分析表明，将聚氨酯134（PU 134）溶解于四氢呋喃中所形成的涂层，其表面粗糙度比其他溶剂降低了40%，表明涂层更加均匀。在生物学应用中，诱导肝内胚层分化，至第9天时可见肝母细胞样细胞，大部分细胞表达细胞角蛋白19、甲胎蛋白以及肝细胞核因子4α，同时白蛋白表达水平较低，作为代谢功能的评估指标。

在重新接种到不同聚合物涂层表面后四天，评估了细胞色素P450的功能。在四氢呋喃-1,3,4-三羧酸涂层表面重新接种的细胞中，代谢活性增加了两倍。这些结果表明，人胚胎干细胞来源的肝细胞代谢活性在P134涂层更均匀的情况下得到改善。对比成像显示，经紫外线或γ射线辐照后无明显差异，扫描电子显微镜分析进一步证实了这一结果。

在经γ射线辐照的PU 1 34包被的玻璃盖玻片上重铺的人胚胎干细胞来源的肝细胞，其CYP 3A活性较在紫外辐射处理的PU 1 34包被玻璃盖玻片上重铺的细胞高出三倍。这些结果表明，γ射线辐照是最佳的灭菌方法。在进行该操作时，需注意检查不同旋涂批次之间包被的均一性，并且切记使用化学溶剂和仪器时可能存在极高危险性。

进行此操作时，应始终佩戴安全护目镜等防护装备。