为什么巢式PCR能提高病毒靶标验证的特异性？

巢式PCR采用两套连续的引物来减少非特异性扩增，从而在早期发现阶段提高对目标序列存在的置信度。

在巢式PCR中，如何通过独立变量的分离来支持检测方法的开发？

分离引物浓度和退火温度等变量可确保扩增的可重复性，这对检测方法的标准化至关重要。

巢式PCR可实现哪些用于临床前评估的定量测量？

巢式PCR可产生可测量的扩增子水平，从而实现病毒载量的定量，支持剂量反应和疗效评估。

为什么在巢式 PCR 中，重复性要求对于跨职能协作至关重要？

在不同实验批次和实验地点之间进行重复验证，可确保结果的一致性，从而实现发现研究、筛选和临床前研究团队之间可靠的数据共享。

在筛查工作流程中实施巢式PCR之前，需要具备哪些统计学分析能力？

必须建立基线变异性及信噪比阈值，以区分真实扩增信号与背景信号，确保检测方法的稳健性。

巢式PCR检测特定病毒基因组序列

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学技术

0 次观看 • 3:20 分钟 • July 8th, 2025

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巢式聚合酶链式反应（nested PCR）可以选择性地扩增特定的基因序列。

为了检测目标病毒序列，首先准备含有外侧引物的预混液，这些引物与包含目标病毒序列的较大DNA区域互补，并加入dNTPs、耐热DNA聚合酶以及适当的缓冲液。

将从病毒感染的细胞中提取的双链病毒DNA加入此混合物中。将试管转移至热循环仪，运行第一轮PCR循环。

变性过程中，双链DNA解离为两条单链模板。在适当的退火温度下，外侧引物结合至其对应的靶序列。随后，DNA聚合酶利用dNTPs延伸引物，生成包含扩增DNA内特定序列的较长扩增产物。

将这些扩增产物转移至新的离心管中。加入含有内侧引物或巢式引物的新鲜主混合液，这些引物靶向较大扩增DNA片段内部更小且更具特异性的序列。进行第二次PCR扩增。

在第二轮PCR中，DNA链发生变性。变性后，巢式引物结合到单链模板上的目标位点，随后在聚合酶作用下进行引物延伸。

重复第二轮 PCR 循环数次，以特异性扩增目标病毒序列。

分析PCR产物以观察较小的扩增片段，确认特异性病毒序列的存在。

取出所需的试剂，并在洁净室中冰上保存，直至准备使用。准备使用时，将试剂解冻并涡旋混匀。接着，根据文本方案中的表2，为每个样本在1.5毫升离心管中配制48微升第一轮PCR反应混合液，并将反应混合液分装至0.2毫升PCR管中。

在模板室的PCR工作站中，将2微升cDNA样品加入第一轮PCR反应体系中。同时加入2微升CVS-11 cDNA作为阳性对照，以及2微升双蒸水作为阴性对照。随后，将密封的试管转移至PCR扩增仪中，按照文本方案中表3所列参数进行扩增循环。

首先，根据文字方案中的表4，在1.5毫升离心管中为每个样本配制48微升的第二轮PCR反应液，并将反应液分装至0.2毫升PCR管中。向第二轮PCR反应液中加入2微升第一轮PCR产物。本轮PCR中以双蒸水作为空白对照。然后，按照文字方案中表3列出的参数进行PCR热循环反应。