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将小鼠的大脑背侧朝上放置。
在显微镜下,分离大脑半球。移开皮层,然后移开海马体,以暴露侧脑室和第三脑室。
采集两个侧脑室脉络丛。这些是富含免疫细胞的脑结构,沿着侧脑室排列,形似长长的面纱。
采集第三脑室脉络丛,该结构较短,表面呈颗粒状。
分离小脑以暴露第四脑室。
采集第四脑室脉络丛,其为一长椭圆形结构,表面呈颗粒状。
将所有脉络丛组织置于含有缓冲盐溶液的离心管中,以维持组织完整性。
加入消化酶溶液,并在振荡条件下孵育。
该酶可降解细胞外基质并使细胞松散。
加入适当的缓冲液以使酶失活。
离心以沉淀细胞。弃去上清液,并将细胞重悬于新鲜缓冲液中,用于后续分析。
首先,将从 C57 black 6 小鼠中分离出的脑组织背侧朝上置于培养皿中,并将培养皿放置在双目放大镜的物镜下方。用镊子固定脑组织,同时将另一把镊子的两个尖端沿大脑半球之间的中线插入。
用镊子将带有胼胝体和海马的皮层从隔区拉开,暴露侧脑室和部分第三脑室。侧脑室内的脉络丛呈长条状薄膜,两端展开,沿侧脑室壁分布,可据此辨认。然后用精细镊子的两个尖端夹取侧脑室脉络丛。注意收集被海马后褶遮蔽的三角形后部区域。
接着,将对侧半球的皮层、胼胝体和海马从隔区拉开,以充分暴露整个第三脑室及对侧侧脑室。使用精细镊子,采集第三脉络丛,其为一表面呈颗粒状的短小结构。随后,采集另一侧的侧脑室脉络丛。
接下来,将镊子的两个尖端插入小脑与中脑之间的区域,分离小脑与脑桥及延髓的连接,以暴露第四脑室。然后,识别第四脉络丛:其为一长条状、呈颗粒状表面的卵圆形结构,位于小脑与延髓之间,沿第四脑室从右侧外侧端延伸至左侧端。使用精细镊子采集第四脉络丛。
将所有收集的脉络丛与IV型胶原酶共同孵育后,轻柔地吹打约10次以完成组织解离。随后,用MACS缓冲液补至1.5毫升以终止IV型胶原酶活性。接着,离心细胞并弃去上清液,再用1.5毫升MACS缓冲液洗涤细胞。加入适当的补偿微珠和抗体溶液后,将样本置于冰上避光孵育30至45分钟。然后,用1.5毫升MACS缓冲液重悬细胞沉淀。