使用标准喷墨打印机创建瞬时细胞膜孔

本实验的总体目标是利用喷墨打印技术在细胞膜上形成瞬时孔隙。首先需要对标准喷墨打印机进行改造，第二步是清空并清洗商用打印机墨盒，以便插入生物墨水。

接下来，将目标细胞悬浮于含有荧光标记肌动蛋白单体和磷酸盐缓冲液（PBS）的溶液中，以制备生物墨水溶液。最后一步是使用经过改造的打印机和墨盒将该生物墨水打印至显微镜载玻片上。最终可通过荧光显微镜观察，证明Fluor four偶联的G型肌动蛋白单体已通过细胞膜上的瞬时孔隙被打印后的细胞摄取。

与标准转染和细胞显微注射技术相比，该技术的主要优势在于操作简便且细胞存活率高。尽管该技术可用于研究遗传学问题，但也适用于细胞生物物理学和组织工程等其他研究领域。利用该技术可方便地观察细胞迁移过程中的细胞骨架变化。

我们最初想到这种方法，是希望可视化细胞受外力作用后细胞骨架排列发生的变化。首先，从打印机底部底座上解开塑料卡扣，然后缓慢取下顶部的塑料外壳。接着，将按钮显示灯板从打印机顶部拆下，但仍保持其与打印机主板的连接。

使用 Kim 擦拭纸和乙醇清洁打印机内部，特别是墨盒放置区域以及打印区域。接下来，找到为 HP DeskJet 500 进纸机构供电的电缆。

它们位于前部左侧的纸盒下方，从主板上拔下电缆。现在找到纸张检测装置，并在送纸机构上方和后方的灰色塑料杠杆上固定一个线圈，作为手动把手，将载物台放置于此处。将用于15个离心管的泡沫运输支架与若干固定在送纸机构前方打印区域内的显微镜载玻片一起使用，以使所需的打印载玻片升至墨盒打印头稍下方的水平位置。

最后，为保持无菌操作技术，将打印机放置于超净工作台内。首先从包装中取出墨盒，保留覆盖在打印机触点和打印头上的保护胶带。使用手持式旋转切割工具时，用夹具固定墨盒本体，并确保绿色顶部不接触任何障碍物。

切下墨盒的绿色顶部，清空储墨槽中剩余的墨水，然后撕下覆盖在打印机触点和打印头上的塑料保护胶带。在此过程中，水可能会从打印头处泄漏，但不会对墨盒造成任何损害。当流出的水变清澈后，让墨盒自然晾干。

为保持清洁的打印环境，首先将墨盒完全浸入盛有去离子水的烧杯中，然后对墨盒进行15分钟的超声处理。超声处理后，取出墨盒并甩去多余的水分。向墨盒内喷入70%乙醇，以创造更无菌的环境。

收获目标细胞后，将细胞置于15毫升锥形离心管中，加入5毫升新鲜培养基，在室温下以250 × g离心5分钟。随后吸除上清液，将细胞重悬于新配制的荧光G肌动蛋白储备液中，浓度为每毫升1 × 10⁵个细胞。制备生物墨水时需注意，250微升生物墨水可打印出三张盖玻片，打印图案如图所示。开启打印机并完成预热后，将所需的打印基底放置于此处，即先前组装好的载台中央，使用22毫米 × 22毫米的盖玻片。

接下来，打开绘图软件程序并选择所需的图案。现在将约 100 至 120 微升的细胞悬液移入卡盒腔室底部的小圆形孔中。在打印机再次预热时打印该文件，卡盒将移动至就绪位置。

当墨盒略微向墨滴井左侧移动并保持在此位置时，向上拉动进纸机构，即可开始走纸和打印。打印机将使用惠普DeskJet 500打印机，将生物墨水打印到置于打印平台中央的盖玻片上，该生物墨水由成纤维细胞悬浮液与G肌动蛋白单体溶液组成。

在HP 26系列墨盒中，将细胞墨水打印到玻璃显微镜盖玻片上。该图展示了一例代表性的成纤维细胞打印结果，显示了掺入的荧光肌动蛋白单体。在上一幅图中，该图案用于在显微镜载玻片的大部分区域形成连续的打印溶液线条。

在此图中，显示了生物连接剂与细胞共同沉积形成的直线。请注意，打印后立即出现背景荧光增强的现象，这是因为悬浮细胞的生物连接剂溶液中含有游离的过量荧光标记肌动蛋白单体；在打印后将细胞孵育约10分钟，有助于细胞贴附到载玻片上，随后用新鲜培养基洗涤可去除基底上多余的单体溶液，从而显著降低背景荧光。此处展示的是三个局部打印区域内打印的三例成纤维细胞的代表性图像；该荧光显微镜照片为打印后15分钟拍摄，显示肌动蛋白呈绿色，细胞核呈蓝色，以及肌动蛋白与细胞核染料信号的叠加图像。

以下两张图片显示了打印后三小时呈线性排列的两个成纤维细胞的荧光显微镜图像。第一张图像显示了细胞内荧光标记的肌动蛋白单体。第二张图像是荧光通道与背景图像的叠加，表明尽管载玻片左下角可能存在一些碎片，但这些碎片并不产生荧光。

最后，本研究展示了一个对照组，即非打印细胞在含有荧光标记单体的环境中孵育三小时，以证明在无细胞打印介导的膜通透情况下，单体无法穿透细胞膜。在尝试该操作过程中，务必准备多个已清洁并可随时使用的墨盒，因为打印机堵塞是导致该技术操作速度减慢的主要问题之一。观看本视频后，您应能够充分理解如何将普通台式打印机改装用于活细胞打印，从而实现瞬时膜受力的构建。