聚合物薄膜与纳米粒子库的组合合成及高通量蛋白质释放

本视频介绍了可生物降解聚酸酐薄膜和纳米粒子库的组合合成方法，以及从这些库中高通量检测蛋白质释放的技术。首先，使用高通量自动沉积装置将组成多样的单体阵列沉积到玻璃比色皿中。随后在180摄氏度、0.3托的条件下进行1.5小时的缩聚反应。

这些反应条件专用于C-P-H-S-A聚酸酐聚合物的合成。使用自动点样装置，将溶剂及用于包封的任何组分沉积到含有聚合物文库的比色皿中。可进行超声处理以确保聚合物完全溶解，并使其他组分均匀分散。

然后将溶解的聚合物转移至含有非溶剂的试管中，通过纳米沉淀法制备纳米颗粒文库。通过真空干燥或过滤回收纳米颗粒，随后转移至经修饰的96孔释放板中。最后，在生理条件下孵育载蛋白文库，并采用荧光标记检测法评估蛋白释放动力学。

最终可以获得显示蛋白质释放动力学随聚合物特性或释放环境条件变化的结果。与传统的逐个样品检测方法相比，该方法的主要优势在于能够同时合成多个样品。随后可对这些样品进行高通量筛选，用于研究蛋白质-聚合物、细胞-聚合物或宿主-聚合物之间的相互作用。

这将加速用于药物递送和组织工程的这些生物材料的合理设计与开发。演示该操作的是我实验室的术后研究员 La Tricia Peterson。在本视频部分，使用 Hyatt 高通量沉积装置，在聚合物合成后沉积具有组成多样性的单体库。

该装置用于制备空白或负载蛋白质的聚合物薄膜或纳米颗粒的组合材料库。该自动化平台由两个可编程的注射泵和三个线性驱动器串联连接至计算机组成。通过 LabVIEW 软件向注射泵和驱动器发送控制指令。

将10 cc气密型注射器装入注射泵中，并通过鲁尔锁接头连接金属毛细管，将聚合物溶液注入玻璃比色皿中。本演示实验中，将使用癸二酸（seic acid，SA）与1,6-双（对氧苯基）乙烷（six Biss para oxy heane，CPH）制备一系列包载德克萨斯红标记牛血清白蛋白（Texas Red Boan serum albumin）的纳米颗粒库。本视频及配套文档中的操作说明可调整用于制备和测试多种聚合物薄膜及纳米颗粒库。

合成文库时，首先将每种单体和氯仿在玻璃小瓶中溶解，终浓度为每毫升25毫克。接下来，通过将溶液从注射器的鲁尔锁端吸入，将每种溶液装入10毫升气密注射器中。去除所有气泡。

接下来，将耐溶剂的螺口不锈钢毛细管连接到注射器末端。用夹子固定毛细管，并将其固定在铁架台上。然后将两根毛细管的末端置于起始液中。

用于单体沉积。将注射器放置在可编程注射泵上，并在实验室视图软件中将其锁定到位。在软件中将线性执行器设置到起始位置。

启动自动化沉积系统，将SA和CPH单体分别注入玻璃比色皿的x、y和Z轴位置。驱动器将准确定位毛细管至各个位置，并通过编程控制向每个比色皿泵入设定体积的各单体，从而构建组分可变的单体文库。完成单体沉积后。

将单体库转移至预热的真空烘箱中，在180摄氏度和0.3托条件下孵育1.5小时，以实现缩合聚合反应。孵育结束后，聚合物库的制备即完成。接下来制备载蛋白聚合物纳米颗粒。

参见配套的实验方案，了解如何制备载蛋白聚合物薄膜文库，以用于构建载蛋白纳米颗粒文库。在此情况下，将蛋白（即德克萨斯红标记的牛血清白蛋白）加入适当的溶剂中，该溶剂应能够溶解聚合物文库。此处使用二氯甲烷作为溶剂，浓度为每毫升含2毫克。

用含有 Texas Red BSA 的溶剂填充 10 cc 注射器，并将其放入第一个注射泵中。然后将一个洁净的空 2 cc 注射器放入第二个注射泵中，并将装有 15 毫升非溶剂（本例中为戊烷）的试管置于小瓶平台旁边的试管架上。接下来，在实验室视图软件中，通过选择相应程序启动自动溶剂沉积过程。

程序启动后，将溶剂加入含有聚合物库的比色皿中，使聚合物浓度达到20毫克/毫升。待所有溶剂加入完毕后，静置1至5分钟，使聚合物充分溶解。随后可选择进行匀质分散处理，以确保聚合物完全溶解且蛋白分布均匀。

接下来，在 LabVIEW 中启动样品转移程序。将样品库中的每种溶解的聚合物样品依次吸入空的注射器中，并分配到样品架中对应的非溶剂试管内。每份样品转移完成后，通过将纳米颗粒库置于真空度为 10 毫米汞柱的真空干燥箱中，或采用真空过滤法除去溶剂，从而回收载有蛋白的纳米颗粒。

为研究包封的BSA的释放情况，首先准备一块经过改造的深孔96孔聚丙烯板，改造方法是去除板上每隔一列的每对相邻列中每个孔壁的顶部约半英寸部分。去除A列与B列、C列与D列、E列与F列以及G列与H列之间各孔的顶部，可在加液至满体积转移时使每对相邻孔之间实现液体流通。将浓度范围为每毫升1000至10微克的德克萨斯红标记BSA标准品加入深孔96孔板中。

这些将用于计算蛋白质数量，并将计入荧光染料淬灭效应。用 PBS 缓冲液重新溶解所需质量的纳米颗粒，然后进行超声处理，以均匀分散颗粒。接着，将纳米颗粒文库转移至深孔 96 孔板中，并等待样品沉降至孔板底部。随后，使用移液器缓慢地向所有相邻的孔中加入 PBS 缓冲液，直至液面距孔顶部约四分之一英寸处。

相邻孔中的缓冲液应足够，以确保液体在孔之间自由流动。接着，用盖子密封释放板，并置于37摄氏度下振荡孵育。在实验期间的各个时间点，使用9,400 Typhoon平板式荧光扫描仪，选择适当的激发光、激光和发射滤光片对板进行扫描。

扫描后，使用图像定量软件量化每次释放中释放出的荧光染料偶联蛋白的量。本实验中，将Texas Red标记的BSA包封于由SA和CPH单体合成的聚合物纳米粒子文库中，具体方法如本视频所述，以测定蛋白释放动力学与聚合物化学性质之间的关系。将载有蛋白的纳米粒子在37摄氏度下孵育一个月，在此期间于不同时间点进行荧光扫描，以定量蛋白的释放情况。

如图所示，本高通量方法被用于测定Texas Red BSA从A-C-P-H-S-A聚酸酐纳米颗粒库中的释放动力学。随着Sarich薄膜化学结构的变化，观察到释放速率呈化学依赖性增加趋势。在使用标准蛋白质定量检测方法时，也获得了类似结果。

在另一项实验中，对CPT CPH聚酸酐薄膜库中Texas Red BSA的释放进行了评估，结果显示接近零级释放动力学，其中富含cpeg的薄膜释放蛋白的速度最快，在医学领域具有作为可生物降解药物递送装置的潜在应用价值。这些结果表明，通过改变聚合物化学结构，可以调控治疗性药物或疫苗抗原所需的释放曲线。在此方法基础上，已开发出其他组合方法，用于研究蛋白质稳定性、细胞毒性、细胞活化以及体内生物分布等领域。

这些方面对于药物递送和组织工程中生物材料的合理设计至关重要。在整个实验方案中，请务必穿戴适当的个人防护装备，并遵循安全的实验室操作规程。