将捕获ELISA转换为使用多重抗体筛选方法的Luminex xMAP检测

以下实验的总体目标是将一种预先优化的用于TNF Alpha细胞因子的Eliza检测方法转换至Xap平台，同时评估替代的抗体配对方案。该目标通过将ELIZA试剂盒中的捕获抗体与另外三种候选捕获抗体分别偶联至四种不同的微球或微珠集合来实现，这些微球集合混合后可同时测试四种候选抗体与四种独立的检测抗体的组合，从而确定最优的抗体配对。

接下来使用两对最优的抗体组合构建两个Xap检测方法。然后从信号强度、动态范围和灵敏度等方面将这些检测方法的性能与原始EISA检测方法进行比较。结果表明，在相同条件下，相似的抗体可能表现出显著不同的性能，并且利用Luminex Xap检测方法可同时筛选多种抗体，揭示该方法相较于EISA具有更高的灵敏度和更宽的动态范围。

该技术相较于现有方法（如酶联免疫吸附试验）的主要优势在于，基于xap的免疫测定法可使研究人员同时检测多个靶标，或如本例所示，同时检测多种抗体，以确定表现最佳的抗体。该实验操作将由Luminex公司的副科学家Erica Lopez完成。

按照书面实验方案所述，首先选择并制备四种针对人TNF alpha的捕获抗体和四种检测抗体。同时，准备一种针对捕获抗体宿主物种的确认抗体。将抗体偶联试剂盒中的试剂恢复至室温。

用选定的偶联反应微球区域编号标记四个反应管。将四瓶磁性plex微球的内容物分别转移至已标记的四个反应管中。每种微球分别用500 µL活化缓冲液洗涤两次，并按照抗体偶联试剂盒说明书，使用磺基ONHS和EDC溶液对每种微球进行活化。

在旋转仪上孵育20分钟后，使用已活化的磁珠，用500微升活化缓冲液重复之前的洗涤步骤，共进行三次。每次洗涤时，配制四份独立的500微升溶液，每份溶液中含有7.5微克捕获抗体的灭活缓冲液。

将这四种捕获抗体溶液分别加入对应的反应管中。立即涡旋振荡每根试管，并在旋转仪上孵育两小时。使用抗体偶联试剂盒中提供的洗涤缓冲液，对已偶联的磁珠进行洗涤步骤，共重复三次，每次使用500 µL洗涤缓冲液。

最后一次洗涤步骤后，向每个反应管中加入 500 微升洗涤缓冲液，使最终储存浓度为每毫升 500 万个抗体偶联磁珠，涡旋混匀，然后对反应管进行超声处理以分散磁珠。使用细胞计数器或血细胞计数板计数偶联反应后回收的磁珠数量。偶联反应的回收率通常超过 90%。通过制备每组偶联磁珠储备液的测试溶液来确认偶联反应是否成功，测试液中磁珠终浓度为每微升 100 个，使用检测缓冲液稀释，并制备 FICO 红细胞标记的抗物种抗体稀释液。

在测定缓冲液中加入每毫升4微克的IgG确认抗体，将每种待测溶液各50微升分装至圆底96孔板的4个孔中，共16个孔。然后向其中8个孔各加入50微升测定缓冲液以检测背景值，向其余8个孔各加入50微升稀释后的确认抗体。使用多通道移液器轻轻吹打数次，使反应液充分混匀。

用封板膜覆盖，于室温下在平板振荡器上孵育30分钟。将平板置于磁力板分离器上1至2分钟，使磁珠脱离溶液。然后将平板倒置于废液容器上方，用力倒掉液体。

每次加入 100 µL 检测缓冲液，重复洗涤每孔两次，并以类似方式从板中移除 SANE。使用磁力板分离器，用多通道移液器轻轻吹打上下五次，将磁珠重悬于 100 µL 检测缓冲液中。在 Luminex xMAP 仪器（如 Magpix 仪器）上进行分析。

该反应的荧光信号强度与磁珠表面的蛋白量成正比，可快速评估偶联到磁珠上的相对蛋白量。为了确定 xap 检测中最有效的抗体配对，通过将每种磁珠各取 10 微升加入至 0.96 毫升检测缓冲液中，制备包含全部四种磁珠的初始混合液。通过将每种检测抗体用检测缓冲液稀释至每毫升含一微克，制备检测抗体溶液。

同时也是一种检测缓冲液。将r和d系统TNFα蛋白标准品配制为2000皮克/毫升，并将链霉亲和素R-藻红蛋白稀释至8微克/毫升。在CoStar圆底96孔板中，向筛选检测的16个孔每孔加入50微升抗体偶联微球混合液。

然后向16个孔中的8个孔加入50 µL检测缓冲液，以测定背景值。接着将50 µL TNF-α标准品加入其余8个孔，以测定反应信号。将板置于酶标板振荡器上，室温避光振荡孵育1小时。

然后向四个孔中分别加入 50 µL 的四种检测抗体，其中两个为背景孔，另两个为反应孔。向所有孔中加入 50 µL SAPE 试剂后，在相同条件下孵育 30 分钟。随后在相同条件下再次孵育 15 分钟。

将平板置于磁力板分离器上静置一分钟。然后将平板在废液容器上方迅速倒置，以去除液体。向16个孔中的每一个孔加入100 µL的检测缓冲液。

然后使用磁力分离法从磁珠中去除液体。接着，向16个孔中的每一个孔加入100 µL检测缓冲液。参照仪器用户手册操作，使用Luminex mag picks仪器读取酶标板。

选择一对能够满足所需信号强度的抗体。在选定最佳捕获抗体后，用10毫升检测缓冲液将100微升该抗体偶联的磁珠储备液稀释。将50微升稀释后的磁珠加入两块CorStar圆底96孔板的78个孔中。

每块板将用于评估不同检测抗体的性能。接下来，使用r和d系统制备12点标准曲线，起始浓度为8,000 皮克/毫升，终止浓度为4 皮克/毫升。

将每种稀释液分别取50微升加入6个复孔中，并在每个板上设置6个孔，每孔加入50微升检测缓冲液作为背景对照，每个板共78个孔。将板在室温下避光孵育1小时，同时在检测板振荡器上振荡。然后向第一块板的全部78个孔中各加入50微升第一检测抗体。

对第二块板上的第二种检测抗体重复上述步骤。在相同条件下孵育30分钟。然后向每块板的所有孔中加入50 µL SAPE试剂。

将两块板在避光条件下振荡15分钟后，将板置于磁力板分离器上1分钟。将板倒置在废液容器上方，用力甩去液体。随后，在移除磁珠上的液体之前，向每块板的78个孔中各加入100 µL的检测缓冲液。

向每块板上78个孔中的珠子各加入100 µL检测缓冲液后，参照用户手册中的操作说明，使用Mag Picks仪器分析各板。根据R&D Systems提供的说明书操作人TNF-α（TNFSF1A）DUOSET ELISA试剂盒。检测R&D试剂盒中提供的标准品所产生的反应。

用其他供应商的 r 和 d 系统捕获抗体与检测抗体，重复 ELI a 测定三次。为简化操作，按供应商配对抗体，并根据 EISA 格式要求，将每对抗体分别与三种 TNF Alpha 蛋白标准品进行评估。Luminex Xap 测定采用多重检测方式，通过将四组 TNF alpha 抗体偶联至 Mag PLX 微球，混合后同时评估全部四种捕获抗体；每种生物素标记的检测抗体分别与四种捕获抗体单独反应，从而可同时确定一种检测抗体与四种捕获抗体之间的相互作用。

结果表明，r 和 d systems DUO 试剂盒中的抗体配对效果最佳，在 XAP 检测中产生的反应信号达到 6,183 中位荧光强度（MFI）单位。同时观察到，当 Millipore 和 ABAM 的检测抗体与 RD systems 的捕获抗体配对时，在 XAP 检测中也能产生较为理想的信号；而 Millipore、ACAM 和 Novus 的捕获抗体在 XAP 检测中表现较差。随后采用 r 和 d systems DUO 试剂盒的实验方案，以 EISA 形式对这四对抗体进行了比较。

所有抗体对均采用r和d系统方案，因为该方案反映了当前广泛使用的典型EIA方案，并且类似于xap技术所使用的方案。EISA检测结果显示，来自r和d系统的抗体对再次给出了最佳结果。Acam的抗体对未产生任何反应，而Millipore和Novas的抗体对仅产生微弱反应，以此评估抗体反应性可能存在的差异。

使用标准品，采用来自三家不同供应商的三种不同重组TNFα蛋白标准品，对全部四对抗体对进行了检测。数据显示，三家供应商提供的重组TNFα蛋白标准品结果相当。来自r和d系统的TNFα蛋白被用于ELSA和XAP检测中生成标准曲线。

尽管ELISA检测使用了R&D Systems的抗体配对，但Xap检测采用了R&D Systems的捕获抗体，以及来自R&D Systems或Millipore的检测抗体。R&D Systems的TNF-α蛋白被稀释，仅产生从8,000至4皮克/毫升的浓度梯度。如图所示，R&D Systems的抗体配对在Xap检测中产生了预期结果，其信号响应超过20,000 MFI。

当使用Millipore的检测抗体替代R&D Systems的检测抗体用于Xap检测时，其检测信号约为使用R&D Systems检测抗体时的30%。本图中的绿色线条代表ELA的标准曲线，其制造商推荐的TNF-α检测范围为每毫升16至1000皮克。由于分光光度计的限制，无法扩大ELISA检测的检测范围。

此外，当以对数尺度作图时，两种方法的动态范围和灵敏度能够更清晰地展现出来。EISA反应与xap检测方法的响应斜率之间存在明显差异，进一步表明在高浓度和低浓度条件下，EL iza检测TNF alpha的能力均更为受限。两种功能性TNF alpha xap检测方法的检测限（LOD）是通过确定可观察到的响应信号高于背景值且超过六次重复实验背景标准差（SD）三倍时的最低TNF alpha浓度来估算的。

在此可以观察到，使用R&D系统配对时，最低浓度为3.91皮克/毫升的TNFα产生了66 MFI的信号响应，该值高于背景信号加3倍标准差的阈值，符合此标准。当使用Millipore检测抗体与R&D系统捕获抗体配对时，检测下限低于7.81皮克/毫升。

在此情况下，第二低浓度的 TNF alpha 产生的响应值比最低浓度 TNF alpha 的响应值高出至少 17 MFI，且超过其标准差的三倍，达到了可接受的响应水平。类似地，r 和 d 系统 duo set Eliza 的检测下限估计为每毫升 63 至 31 皮克。按照此流程，还可进行其他步骤，如测试不同的样本基质或报告抗体的不同浓度，以进一步优化 xap 检测。