用于动态研究红细胞聚集的可控微流控环境

本实验的总体目标是在受控且恒定的剪切速率条件下，直接动态量化微循环中的红细胞聚集物。首先，将红细胞悬液与磷酸盐缓冲盐水溶液在双Y型微通道中混合，从而在血液层中建立恒定的剪切流；第二步，利用高速相机对流动过程进行可视化并记录影像。

接下来，使用图像处理技术对记录结果进行处理，获得微通道中聚集体的平均尺寸及聚集体尺寸分布。最后一步是通过追踪微通道中荧光颗粒在连续两帧图像间的位移来确定血液流速。最终，根据血液流速和血层厚度计算微通道中的剪切速率，从而将聚集体尺寸与相应的局部剪切速率关联起来。

与现有的透射光法相比，该技术的主要优势在于，可在显微共享流动条件下对红细胞聚集体进行动态分析，而非采用其他技术进行静态统计分析。该方法有助于回答血液流变学领域中的关键问题，例如理解红细胞聚集体形成的条件，以及揭示血液在微循环中的流变行为。首先，根据标准的光刻方法，制备宽120微米、高60微米、长7毫米的微通道。

接下来，从健康志愿者供者中采集血细胞，并按照随附文本方案制备红细胞压积水平分别为5%、10%和15%的红细胞悬液；取每种红细胞悬液1毫升，与60微升含荧光示踪颗粒的1%溶液混合。轻轻摇动试管以混匀溶液。同时，将相同体积的示踪颗粒加入1毫升pH为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中。

用含有红细胞的示踪剂溶液填充一支25微升玻璃注射器和一支100微升玻璃注射器。示踪剂溶液使用PBS配制，确保系统中无气泡存在。随后将微流道置于倒置显微镜载物台上，显微镜连接可每秒记录18帧或更高帧率的高速相机，以及微粒图像测速系统。

通过管路将每个注射器连接至微流控通道的一个入口端口，然后将其装入同一注射泵的支架中。编程控制注射泵，使25微升注射器以每小时2微升的速率 dispensing。由于尺寸差异，100微升注射器将以该速率的四倍同时进行dispensing。

在不同实验之间调整流速，以测试不同的剪切速率。使用校准目镜并配合 20 倍物镜对高速相机进行校准。然后启动泵，开始将两种溶液注入微通道中。

确定最佳的相机曝光时间，以清晰成像聚集体。在开始任何测量之前，必须等待流动达到稳态。

如果在三到五分钟内达到稳态，应重新填充注射器以混匀溶液，并使红细胞保持悬浮状态。一旦达到稳态流动，即开始记录红细胞的运动。

记录七秒的流动过程。使用具备图像处理功能的程序，通过直方图均衡化方法增强所获取的每幅灰度图像的对比度。随后，将灰度图像转换为二值图像。

通过测试多个阈值并选择能够正确检测出所有聚集体的值，仔细设定阈值。如有必要，填补单个聚集体内部空隙对应的孔洞。然后通过在二值图像中确定相邻的白色像素来检测细胞，使相邻的细胞被识别为聚集体。

标记检测到的不同红细胞聚集体，然后将二值图像转换为红绿蓝图像，以实现更好的可视化效果。最后，将红绿蓝图像叠加到原始图像上。为了验证图像处理的效率，根据检测到的像素数量计算每帧中每个聚集体的面积。

以相同方式处理所有帧。接着，对每帧中检测到的聚集体尺寸取平均值，然后对所有帧的结果进行平均。为获得红细胞悬浮液引擎每次记录的平均聚集体尺寸，使用标尺图像将结果转换为平方微米。

然后计算单个红细胞的面积，以确定一个代表性数值。在获取数据后，估算每个检测到的聚集体内红细胞的数量。使用高速相机时，切换至双脉冲相机，用于微粒图像测速系统。

使用成像软件（例如此处所示的软件）进行流动图像的采集以及速度场测定的图像处理。务必佩戴防护眼镜，然后打开激光系统和相机。将显微尺置于显微镜下，并利用所得图像对系统进行校准。

然后启动流体流动，观察两种流体中的颗粒。通过聚焦流中移动最快且最明亮的颗粒，确定微通道的中位平面。接下来，将帧间时间间隔设置为约2毫秒，使最快的颗粒在两幅图像之间移动5到10个像素，并开始记录流动O。将软件设置为针对所有不同红细胞悬浮液及不同剪切速率条件下采集100对图像。

完成图像预处理后，选择相关窗口的大小和形状，以及图像重叠的百分比。将结果表示为基于100对图像计算得到的平均速度场及速度的均方根误差。

关闭激光相机和计算机。在完成所有测量和图像处理后，首先根据高速相机的录像检测并估算微通道中血液的厚度，从而计算剪切率。为此，对特定录像中的所有帧取平均值，以获得该视频的背景图像。

最后，通过目视检查所有帧的平均图像并手动检测血层边缘，来确定血层厚度。然后从提取的速度分布中手动获取对应血层厚度的速度值，并通过将速度值除以血层厚度来计算剪切速率。此处显示的厚度为在连续三帧中检测到的四个红细胞聚集体的净运动结果。

由超过30个细胞组成的大聚集体以红色显示。由9至30个细胞组成的中等聚集体以绿色显示，由少于9个细胞组成的小聚集体以蓝色显示。聚集体的流速根据其在微通道中的位置而变化。

以下是红细胞在5% hematocrit、10% hematocrit和15% hematocrit浓度下，以10 µL/h流速悬浮时的速度分布曲线。可以看出，两侧边缘处的速度均趋近于零，符合预期；同时，随着总体剪切率的增加，不同hematocrit水平下两股流体之间的拐点略有变化，且各hematocrit水平下的聚集体尺寸减小。这是由于微通道内的剪切力超过了红细胞的聚集力，导致红细胞发生解聚所致。

在进行该操作时，重要的是要注意确保微通道内流动图像的质量，并保证流动的红细胞与图像背景之间具有良好的对比度。观看本视频后，您应能够充分理解如何在可控流动条件下对红细胞聚集进行定性和定量分析。