功能互补分析（FCA）：一种设计并实施用于辅助生化途径教学的实验课程

功能互补实验的总体目标是通过将相应基因的功能性拷贝导入突变细胞中，观察其是否能在突变背景下恢复野生型表型，从而阐明某种酶的活性。该方法有助于回答生物化学、微生物学、遗传学、植物生物学、进化等多个领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它能够在通常具有生理性质的体内条件下评估酶的功能、活性和/或作用，而不同于通常为人工环境的体外条件。

该技术的意义在于有助于识别和/或阐明尚未明确表征的酶的功能，以及仍具有假设性或预测性功能的酶。本实验的功能互补操作由生物技术与分子生物科学专业学生、我实验室的泰勒·哈克尼斯（Taylor Harkness）演示。根据文本方案完成 DapL、TarB、MurE 和 RSH 基因的克隆后，用单个突变细菌菌落接种 50 毫升液体培养基，用于转化目的基因，并过夜培养。

第二天，用50毫升过夜培养物接种1升合适的培养基，在30摄氏度下培养至对数生长期，或培养至OD600为0.4至0.6。在4摄氏度下以5,000 × g离心15分钟收集细胞。然后倒掉上清液，加入500毫升无菌、冰冻的蒸馏水重悬沉淀。

再次离心细胞，弃去上清液后，加入250毫升无菌、冰预冷的10%甘油重悬沉淀。最后一次离心细胞后，用2毫升10%甘油重悬细胞。将50微升分装液转移至微量离心管中，并立即放入干冰乙醇浴中快速冷冻。

将细胞在负80摄氏度下保存，用于电穿孔。进行电穿孔时，向50微升感受态细胞中加入1微升重组质粒，冰上放置5分钟。将细胞转移至电穿孔比色皿中，并将电穿孔仪设置为以下参数：25度 Fahrenheit 电容、2.5千伏和200欧姆电阻。

然后将比色皿放入仪器中，施加一个电脉冲。向比色皿中加入1毫升复苏培养基，将细胞转移至15毫升锥形管中。将细胞置于摇床培养箱中，在适合该突变株的温度下，以温和转速振荡培养60分钟，使其恢复。

为筛选转化子，用移液器吸取100微升培养物滴加到含琼脂平板的培养基上，并使用无菌涂布棒将溶液均匀涂布。然后在适当的温度下过夜培养。更多细节请参见文字版实验方案。

为了进行互补分析，通过电穿孔将空载体pBAD33或dapL表达载体转化至AOH1中，方法如前所述。将转化混合物涂布于LB琼脂培养基上，培养基中添加50 µg/mL二氨基庚二酸（Dap）、34 µg/mL氯霉素和50 µg/mL卡那霉素。将平板置于30 °C培养24小时后观察结果。

使用空载体 pBAD33 或表达 murE 的载体，通过本视频前面演示的电穿孔法转化 TKL-11 突变株。将转化子涂布于 LB 琼脂平板上，平板中添加 50 微克/毫升硫胺素和 34 微克/毫升氯霉素，在 30 摄氏度下孵育 24 小时后检查转化子生长情况。通过划线或涂布的方法，将对照组和实验组转化所得的菌落分别接种到两块含有 0.2% 阿拉伯糖和 50 微克/毫升硫胺素的 LB 培养基平板上，以检测互补效应。

将一个平板在30摄氏度下孵育，另一个平板在42摄氏度下孵育，24小时后观察生长表型。将新鞘氨醇菌属（novosphingobium）的突变株Hx699和野生型Rr217分别与pRK290空载体或含有天然rshNsp基因的载体进行转化，每种菌株各进行两次独立的转化实验，具体操作如本视频前面部分所示。将转化子接种于添加了10 µg/mL四环素的马铃薯葡萄糖琼脂（PD琼脂）平板上，孵育至少72小时，或直至转化子菌落可见。

然后，用四环素新鲜的 PD 琼脂平板以 X 型划线法接种转化子。在 30 °C 下培养至少四天后，肉眼观察两个平板的生长表型。大肠杆菌双突变株 AOH1 在 DapE 基因中存在突变，并缺失 DapD 基因，因此除非提供 Dap，否则无法生长。

如图所示，表达 DapLs 的 AOH1 突变体能够通过 Dap 溶解途径将 THDP 转化为 LLDap，从而在不含 LLDap 的培养基上生长。MurE 酶促进 m-DAP 掺入革兰氏阴性菌的肽聚糖中。大肠杆菌 MurE 突变体 TKL-11 在 42 摄氏度下无法生长。

在此实验中，只有携带 MurE 的 TKL-11 细胞能在 42 摄氏度下生长。TyrB 基因的突变会阻碍酪氨酸和苯丙氨酸的合成。然而，如图所示，当 TyrB 突变株 DL39 表达拟南芥（A.thaliana）At5g36160 基因时，其可在缺乏酪氨酸和苯丙氨酸的 M9 培养基上生长，表明该酶能够合成酪氨酸。

诺卡氏菌属的 Hx699 突变体携带一种无功能的 RSH 蛋白，产生低黏液表型。然而，当该突变体转化了天然 RSH 基因后，在多细胞 X 型菌落中会产生更多的可溶性胞外多糖，呈现高黏液表型。相比之下，当 Hx699 突变体转化空载体时，则仍表现为低黏液表型。

一旦掌握，该技术可在大约24至48小时内完成。若操作得当，且排除克隆、感受态制备和转化步骤，具体时间取决于所用模式生物的生长情况。在进行该实验时，重要的是要牢记功能互补分析中所用突变体的生长条件要求。

完成此操作后，还可采用其他方法，如传统的体外公理化表征，以回答更多问题，例如底物特异性、最适温度和最适pH值、体细胞迁移速率等。该技术建立后，将为生物学及其众多分支领域（如微生物学）的研究人员阐明来自多种生物体的酶在体内的功能或作用提供重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备电转感受态细菌细胞、如何利用电穿孔法转化细菌，以及如何通过功能互补实验评估基因/酶的功能。

请勿忘记，操作病原体可能具有极高危险性，必须采取必要的预防措施。