利用溴尿苷三磷酸链特异性转录延伸（TRO）方法分析转录终止

本实验的总体目标是利用链特异性转录延伸法，在体内条件下研究酿酒酵母中RNA聚合酶的转录终止过程。该方法有助于回答一个关键问题：在基因3'端以外检测到的具有转录活性的聚合酶是否确实起始于启动子区域。该方法的主要优势在于，能够区分从启动子区域起始、转录mRNA的聚合酶与非特异性起始、在基因3'端持续转录的聚合酶。

由于不同RNA聚合酶介导的转录终止过程具有保守性，该技术可进一步拓展用于研究其他RNA聚合酶以及酵母中的转录终止。尽管该方法有助于深入理解终止因子在酵母转录周期中的精确作用，也可进一步应用于高等真核生物中转录终止的研究。通常，初次使用该方法的研究人员在细胞通透化和转录延伸终止步骤上会遇到困难，因为这些步骤需要精细操作，同时新生转录本的纯化也可能具有挑战性。

我们最初是从GRO seek方法中获得本方法的思路，该方法能够以链特异性方式提供全基因组范围内转录活性聚合酶位置的快照。此方法的可视化演示至关重要，因为转录反应和RNA纯化操作较为困难，这源于新生转录本的含量极低且性质不稳定。在开始转录反应之前，需培养、收获并通透化处于对数生长期的酵母细胞，以获得通透化的细胞沉淀。

开始反应时，向透化的细胞样品中加入 150 微升转录延伸缓冲液。使用截短的 P-200 吸头，通过上下轻柔吹打混合。将样品置于冰上。

将所有样品重悬于转录反应缓冲液后，于30摄氏度水浴中孵育5分钟。向每个样品中加入500微升预冷的即用型RNA提取试剂以终止反应，然后在室温下孵育5分钟。

通过向每份细胞悬液中加入200微升经酸洗涤的玻璃珠，开始RNA提取步骤，并在4摄氏度下使用涡旋振荡器剧烈振荡20分钟。20分钟后，使用加热的22号针头刺穿每个微量离心管底部，将管子置于一个15毫升无菌锥形管的上方。在4摄氏度下以300 × g离心1分钟，然后将细胞裂解物转移至1.5毫升微量离心管中。

向细胞裂解液中加入500微升冷RNA提取试剂和200微升氯仿。在涡旋振荡器上混匀内容物，然后在4摄氏度下以16,168 ×g离心20分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中。

加入等体积的冷酚-氯仿-异戊醇。在涡旋振荡器上剧烈振荡，然后在4°C条件下以16,168 ×g离心15分钟。将含有RNA的上层水相转移至新的微量离心管中。

加入等体积的冷酚-氯仿-异戊醇，涡旋混匀后再次离心。向最终含有RNA的水相中加入适量5摩尔的氯化钠储备液，使终浓度达到0.3摩尔。加入三倍体积的冷乙醇以沉淀RNA。

在20摄氏度下孵育一小时或过夜。RNA沉淀完成后，在4摄氏度下以16,168 × g离心20分钟。弃去上清液，并将RNA沉淀物重悬于100 µL的DEPC水中。

使用RNA提取试剂盒将RNA与未掺入的溴代尿苷三磷酸核苷酸分离，并用100微升无RNA酶的水从柱子上洗脱RNA。将RNA置于65摄氏度水浴中孵育5分钟，然后转移至冰上至少2分钟。

在RNA沉淀的同时，开始准备抗溴脱氧尿苷（bromo DU）磁珠。每个样品中加入500微升0.25倍浓度的磷酸盐缓冲生理盐水EDTA结合缓冲液至25微升沉降磁珠中。在4摄氏度下以200 × g离心30秒，弃去上清液。

用结合缓冲液洗涤磁珠三次。第三次洗涤后移除上清液，向磁珠中加入500 µL封闭缓冲液，在4°C的摇床中轻轻振荡孵育一至两小时。再用500 µL结合缓冲液将磁珠洗涤两次。

除去第二次洗涤的上清液，向磁珠中加入400微升结合缓冲液。将100微升RNA直接转移至磁珠中。在4°C条件下，于摇床中轻柔振荡孵育1至2小时。

在4°C条件下，以200 × g离心30秒，然后弃去上清液。接着向珠粒中加入500 µL结合缓冲液。在4°C条件下，以200 × g离心30秒，然后弃去上清液。

以这种方式，依次用结合缓冲液、低盐缓冲液、高盐缓冲液和TET缓冲液洗涤磁珠两次。为从磁珠上洗脱溴尿苷三磷酸标记的RNA，加入150 µL洗脱缓冲液，在42°C水浴中孵育4分钟。短暂离心后收集上清液。

以这种方式，先用150微升洗脱缓冲液连续洗脱两次，再用200微升洗脱一次。每个样品应获得约500微升亲和纯化的溴尿苷三磷酸标记RNA。为沉淀亲和纯化的溴尿苷三磷酸标记RNA，向每个样品中加入500微升冰冷的苯酚-氯仿-异戊醇混合液。

涡旋混匀，并在4°C下以16,168 × g离心15分钟。将上层水相转移至新的微量离心管中。加入适当体积的5 M氯化钠储备液，使终浓度为0.3 M。

然后加入三倍体积的冷乙醇。在20摄氏度下孵育过夜，以沉淀RNA。次日，在4摄氏度下以16,168 × g离心30分钟，收集沉淀的RNA。

去除上清液，将RNA沉淀在空气中干燥10分钟。用26微升DEPC水重悬RNA沉淀。使用分光光度计在260纳米处测量吸光度，以确定最终RNA浓度。

将RNA样品及其分装 aliquot 储存于 -80 °C，直至进行cDNA合成时使用。采用溴尿苷三磷酸链特异性转录延伸实验，检测RNA 14在酿酒酵母ASC1基因转录终止过程中的必要性。从RNA 14-1突变株及其同基因型野生型细胞中纯化溴尿苷三磷酸标记的RNA，并使用引物C、D、E、F和G进行逆转录。随后利用引物对B与C、B与D、B与E、B与F以及B与G对相应的cDNA进行PCR扩增，并在琼脂糖凝胶上进行分离。

在突变体中，引物对 B 和 E、B 和 F 以及 B 和 G 的 PCR 扩增产物的存在，反映了终止子通读表型。然而，在野生型细胞中，转录延伸信号仅限于终止子元件处，终止子区域之外未检测到明显的转录延伸信号。该图显示了以五种 S RNA 作为归一化对照的凝胶定量结果。

在突变细胞中检测到启动子起始的新生转录本能够通读终止信号，而在野生型细胞中则不能，这证实了RNA 14是一种终止因子。一旦掌握，该技术可在三天内完成。在进行此实验操作时，需特别注意转录延伸反应对于获得成功结果至关重要。

在完成此操作后，可进一步采用其他方法（如 GRO 测序）来回答更多问题，例如某个因子在全基因组范围内对转录终止的作用。该技术一经建立，便为转录领域研究人员探索酵母及其他高等真核系统中其他 RNA 聚合酶的终止机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何开展转录延伸反应以及如何纯化新生标记的转录产物。

请注意，RNA 可能极不稳定，因此在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套、保持约 4 °C 的低温环境，以及使用无 RNA 酶的试剂。