利用乳腺癌存档样本优化基于RNA的多重表达检测方法

该方法已成功优化，可用于将乳腺癌患者分类为已知治疗组和未知治疗组。本检测具有高灵敏度，可识别出异质性样本，并可进一步利用激光显微切割技术进行研究。基于RNA的多重检测主要优势在于，可使用苏木精和伊红染色的甲醛固定石蜡包埋存档材料，结果具有良好的重复性，能够获得高分辨率数据并实现生物标志物的验证。

按照文本方案中的描述准备组织。开始解剖前，设定载玻片的边界并校准显微镜载物台的移动。随后使用4X物镜扫描染色的膜片。

在膜玻片上选择并圈出显微切割的目标区域，记录总面积。为确保后续RNA分析的充分性，所需面积至少为42平方毫米。

然后按照设定的参数启动激光切割。接着，使用帽盖提升机制取出分离的组织片段，并将其放置在已标记试管的散射帽上，该试管连接于机械臂装置。如果未能将分离的组织片段成功转移至帽盖上，则需重复目标区域的分离操作。

显微切割的准确性是关键步骤，应始终确保盖片上显微切割区域与标记并扫描的图像完全一致。根据需要收集尽可能多的组织切片，每份切片分别置于独立的离心管中，随后进行组织样本的裂解。进行裂解时，每平方毫米组织面积加入2.4 µL匀浆液，然后以最大速度涡旋振荡各样本10秒。

接下来，将样品在2,500 ×g条件下离心5秒。然后根据需要将样品转移至1.5毫升离心管中，并置于65°C的振荡加热金属块中。以600 rpm振荡12至18小时。

然后在室温下以 21,000 g 离心裂解物 5 分钟。小心地将澄清的上清液收集到一个新的已标记的离心管中。避免转移任何组织碎片。

上清液可在负80摄氏度下保存。在准备好基于杂交检测的所有试剂后，向一个磁性分离96孔板中最多90个孔加入25微升组织匀浆液。将对照样品各25微升加入三个指定孔中，并将25微升匀浆液加入另外三个孔中作为空白对照。

然后使用透明塑料压封膜密封磁力分离板，并将该板置于54摄氏度的振荡培养箱中孵育18至22小时。次日，将板固定并锁定在手持式磁力板洗涤器上，随后移除压封膜，静置1分钟使磁珠沉降。现在进行洗涤步骤。

将平板置于水槽上方沥干，并用纸巾轻轻吸干，然后向所有孔中加入100微升1X洗涤缓冲液，静置15秒。重复此过程三次，以完成洗涤步骤。最后一次洗涤液去除后，向各孔重新加入50微升预扩增试剂，然后用铝制封板膜密封平板，在室温下以800 rpm振荡1分钟。

然后在 50 摄氏度下继续振荡孵育 1 小时。完成后，再进行一次洗涤步骤。接下来，向各孔中重新加入 50 µL 放大试剂，用铝封板密封，重复振荡孵育：室温下 1 分钟，随后在 50 摄氏度下 1 小时，之后再进行一次洗涤步骤。

现在将标记探针在最大速度下涡旋振荡10秒，然后向每个孔中加入50 µL标记探针。随后重新密封酶标板，并重复之前的振荡孵育步骤，接着进行另一次洗涤。接下来，向各孔中加入50 µL新鲜配制的链霉亲和素-藻红蛋白，然后在室温下以600 rpm进行振荡孵育，随后使用链霉亲和素洗涤缓冲液进行洗涤步骤。

完成洗涤步骤后，向每个孔中加入100微升链霉亲和素洗涤缓冲液，并用铝制板封膜密封，然后在室温下以800 rpm振荡3分钟。在最后一次孵育期间，启动磁珠分析仪，并确保仪器已完成校准并执行了验证程序。在软件中，转到“批次”选项卡，选择“使用现有方案创建批次”，以添加新的分析任务。

接下来，在板布局中，将孔指定为未知样本或空白，并在样本面板中为每个孔提供标签。现在取下反应板上的铝制密封膜，弹出板加载托盘，将板放入分析仪中。然后，单击“Retract”，再单击“Run Batch”以启动分析仪。

读取完成后，弹出反应板，并按照制造商的建议清洁磁珠分析仪。进行分析时，进入“批次结果”选项卡，选择相应的分析文件，并将其导出为 csv 文件，然后使用电子表格软件计算平均值和原始数据。

确保对照组显示出预期信号。使用数据科学平台或预定义算法对样本原始数据进行归一化处理，并通过主成分分析评估数据分布。多重微球读数仪及检测的性能至关重要，在检测珍贵的患者样本前，应先对经过充分注释的对照样本进行系列稀释检测，以确保结果准确可靠。

对于属性，选择标准化基因数据的一个子集以及一个名义变量（例如乳腺癌亚型）。应用经过训练和验证的分类算法来表征未知样本。该方法已用于在经苏木精-伊红染色、显微切割且高度降解的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中同时检测40种转录本。

利用该方法，可在比较不同受体阳性与阴性亚型的肿瘤组织及其配对对照组织时，准确表征受体状态以及间充质标志物FN1的差异表达。该方法可用于表征肿瘤内部的异质性。一个雌激素受体（ER）阳性肿瘤在呈现不同肿瘤形态和有丝分裂活性的区域中，表现出FN1的空间差异表达。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在目标 RNA 与微珠杂交、信号扩增和定量之后，直接从组织裂解液中检测多个基因。该检测方法的灵敏度允许使用激光显微切割获取的样本。在进行该实验操作时，重要的是每次检测前需校准仪器，并在处理珍贵的患者样本前，利用质控样品确定方法的灵敏度范围。

该检测流程易于在临床实验室中推广应用。在两天内，可在12小时内完成多达90个样本的RNA谱分析。在病理实验室中检测乳腺癌受体状态耗时较长，且需要经验丰富的病理医师。

使用这种数字化的多重微球试剂盒可准确量化RNA表达。在初次诊断中对活检组织中的部分生物标志物进行分析，能够反映肿瘤的特征。采用更广泛的生物标志物组合，并结合整张组织切片进行检测，可识别出具有异质性的样本。

采用该方法学的检测开发具有高度的灵活性，且所需样本量较少。样本包括对生物标志物验证至关重要的临床注释样本，以及对患者监测和早期诊断具有重要意义的液体活检样本。