优化利用液体处理机器人对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行高通量正向化学生物学筛选

本实验方案的总体目标是对拟南芥幼苗进行高通量的正向化学遗传学筛选。通过该方法，我们能够高效且有效地发现影响植物生理功能的新型小分子。这些发现将为进一步研究生理过程（如细胞壁合成）奠定基础。

该技术的主要优势在于，可在短时间内筛选数以万计的小分子。尽管本实验方案是为模式植物拟南芥（Arabidopsis）设计的，但也可轻松适用于其他生物体，例如昆虫、微生物或细胞培养。我们最初产生该实验方案的想法，源于得知学校基因组中心需要为一台多余的液体处理机器人寻找使用场所。

我们立即主动提出接手这项工作。按照文本方案中的描述，准备稀释文库以及多通道移液头清洗自动实验室器皿定位器（Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner，ALP）。手动装载连接至堆叠器转盘的10位堆叠器（Stacker 10s）。

在酒店 A 至 D 中，首先在一号房间加载一盒 AP96 P20 吸头。然后在二至五号房间各加载四块 96 孔 V 型底板，其中两块上层板中包含订购文库的储备浓度溶液，另外两块下层板为空。此外，在六号房间加载一盒 AP96 P20 吸头。

在七至九号房间中放置四个96孔V型底板，其中上方两个板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个板为空板。在P3位置的储液槽中加入300毫升水，在P7位置放置300毫升70%乙醇浴，同时在甲板上设置Tip Loader ALP和Multichannel Tip Wash ALP。使用液体处理机器人的操作软件，从Stacker 10中取出AP96 P20吸头并将其移至Tip Loader ALP。

将A酒店的二号房间中的四个96孔V型底板分别放置在甲板上，底部两个置于P4和P8位置，顶部两个置于P5和P9位置。使用Tip Loader ALP将AP96 P20吸头加载至96通道200微升吸头头上。从300毫升的水储液槽中吸取90微升液体，分配至P4位置的96孔V型底稀释板中。对P8位置的板重复此步骤。通过反复吸取和分配15微升液体三次，混匀P5位置的化合物文库板。此外，从P5位置的化合物文库板中吸取10微升液体，分配10微升至P4位置的稀释板中。通过反复吸取和分配50微升液体共三次，混匀P4位置板中的溶液。

混合后，用AP96 P20移液器吸头从P7中吸取并排空70微升70%乙醇，以清洁吸头，然后在多通道吸头清洗板ALP中通过吸取并排空110%体积的水四次进行清洗。对P8和P9上的第二对板重复这些步骤。在制备第二个96孔V型底稀释板后，将P9、P5、P8和P4板按从下到上的顺序堆叠。然后将该堆叠放置在一个空的静态ALP上。

使用 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13 中的任意一个。重复这些步骤，直到 A 酒店五号房间清空，然后在到达六号房间时重新开始该过程，将新的 AP96 P20 吸头移至 Tip Loader ALP，并将使用过的 AP96 P20 吸头放置在空的静态 ALP 上。重复此操作，直到 A 酒店九号房间清空为止。

为了继续前往B酒店，必须将甲板上的板和吸头重新装入A酒店。尽管机器人可以无人监管运行，但每次稀释循环后仍需手动补充水箱。如果循环重新开始时水量不足，机器人将吸入空气，导致化学品无法被稀释。请手动补充300毫升的水箱。

计算机程序可插入一个显示此消息的暂停步骤，要求用户点击“继续”后才能执行下一步操作。对剩余的三个培养物重复上述稀释步骤。以每100毫升培养基加入0.1克种子的密度，手动将种子添加到培养基中。

此密度可使每块96孔板的每个孔中平均含有3-10粒种子。将四块96孔平底板手动放置于A酒店的一号和二号房间内。在Tip Loader ALP上放置一盒AP96 P250吸头，在P3位置放置一个装有培养基-种子混合液的300毫升储液槽，在P7位置放置一个装有70%乙醇的300毫升储液槽。通过操作软件，将A酒店的一号和二号房间中的四块板堆栈分开，并将每块板分别放置于空的静态ALP上，然后在96通道200微升移液头装载AP96 P250吸头。

从P3上的300毫升培养基-种子储液槽中吸取90微升，加入第一个96孔平底板中。重复此操作，直至全部八个板均含有培养基-种子混合物。使用P7上装有70%乙醇的300毫升储液槽，通过吸取和排出70微升液体来清洗AP96 P250移液器吸头。然后在Multichannel Tip Wash ALP中用纯水清洗吸头，每次吸取和排出110%体积的水，重复四次，最后在TL1处卸下吸头。

最后，手动收集这些板。将一盒AP96 P250吸头手动放入A酒店的第一间房间。同时，将两个96孔V型底稀释文库板放入第二、第四、第六和第八间房间。将两个96孔平底筛选板放入第三、第五、第七和第九间房间。

使用操作软件，将操作台配置为在 P7 位置放置一个含有 300 毫升 70% 乙醇的清洗储液槽。培养基-种子储液槽可保留在 P3 位置。此外，通过连接设备控制器启动控制台驱动，使水在多通道吸头清洗 ALP 中循环。此步骤将在程序结束时自动关闭。从 Hotel A 取出 AP96 P250 吸头盒，并将其移至吸头装载 ALP。

接下来，将来自A酒店二号房间的96孔V型底稀释文库板呈递至操作台。将一块板放置在静态ALP P4位置，另一块板放置在P8位置。然后，将来自A酒店三号房间的96孔平底筛选板呈递至操作台。将一块板放置在静态ALP P5位置，另一块板放置在P9位置。使用Tip Loader ALP将AP96 P250吸头装载到96通道200微升移液头。

在P4位置，通过吸取并分配50微升液体三次，混匀96孔V型底稀释板。随后，从此板中吸取10微升液体，加入至P5位置的96孔平底筛选板中。在P5位置，通过吸取并分配50微升液体三次，混匀该板中的溶液。使用乙醇清洗AP96 P250移液头：从P7位置的储液槽中吸取并分配70%乙醇70微升，进行清洗。然后，在Multichannel Tip Wash ALP中用纯水清洗移液头，吸取并分配110%体积的水四次。

对第二个96孔V型底稀释文库板和96孔平底筛选板重复上述步骤。将两个96孔V型底稀释文库板叠放在一起，两个96孔平底筛选板也叠放在一起。将这些板转移至静态ALPs。

然后，重复该过程三次，总共向筛选板中添加八次稀释后的化学物质。最后，通过肉眼观察确认筛选板中每个孔内的种子数量。对于种子数量少于三粒的孔，补充已灭菌并经过春化处理的种子。

必须确保幼苗生长的培养基不会干燥，否则将导致发芽率降低。含有幼苗的培养板应保持在高湿度环境中，或储存在防干燥容器中。将96孔平底筛选板置于密闭防干燥容器内，在环境培养箱中于22°C、16小时光照/8小时黑暗的条件下培养4天。

在解剖显微镜下观察96孔平底筛选板，并记录所有异常表型以供进一步研究。正常与异常表型的示例包括：无可见形态学异常、根毛呈棕色、根发育迟缓、根严重矮缩、白化、黏液呈绿色、萌发不完全以及未萌发。以百分比形式显示的可见表型用饼状图表示。

幼苗在根系形态、色素沉着、根毛和萌发方面表现出异常。此外还包括其他多种表型，例如产生绿色黏液。一旦掌握该技术，可显著提高大规模正向化学遗传筛选的效率和准确性。

在进行该实验操作时，务必注意对种子进行灭菌和春化处理，在稀释步骤中及时补充水槽中的液体，确保样品保存在防潮容器中，并且所有成像均在平底培养板中进行。根据您所关注研究的生理过程，可在此初步筛选的基础上进一步开展其他检测实验，以帮助确定每种化合物的作用机制。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用液体处理机器人提高化学遗传筛选的效率和准确性。