利用点击化学辅助的RNA相互作用组捕获（CARIC）策略捕获与鉴定RNA结合蛋白

该方法CARIC通过全面清查RNA结合蛋白，有助于解答基因转录后调控领域的关键问题。CARIC的主要优势在于能够捕获与多种RNA（如mRNA和非编码RNA）结合的蛋白质。该方法可应用于多种类型和生物体，用于研究RNA-蛋白质相互作用。

首先，在37摄氏度、5% CO2的培养箱中，用添加补剂的DMEM培养HeLa细胞。当细胞融合度达到约80%时，将每皿中的培养基更换为15毫升预热的新鲜培养基。向每皿中加入15微升100毫摩尔的EU，使其终浓度为1毫摩尔。

对于实验组和无紫外照射的对照组样品，向每皿中加入 7.5 微升 100 毫摩尔的 4 SU。用铝箔包裹培养皿，并按照先前的条件培养细胞 16 小时。此后，向相应的培养板中加入先前剂量一半的 EU 和/或 4 SU，继续培养 2 小时。

开始体内交联实验时，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每皿三次，每次使用5 mL PBS。尽可能彻底去除残留的PBS。对于实验组和无4 SU对照组样品，将培养皿置于冰上并打开皿盖。

使用紫外交联仪，在365纳米波长、2焦耳/平方厘米的条件下照射细胞。对于无紫外照射的对照样品，将培养皿置于冰上并避光保存。接着，向每个培养皿中加入1毫升预裂解缓冲液。

使用橡胶细胞刮刀刮取细胞，并将裂解前悬液收集至15毫升离心管中。向含有两块培养皿细胞悬液的离心管中加入裂解前缓冲液，调节总体积至6毫升。然后加入等体积的R裂解缓冲液。

用带有细针的注射器将细胞裂解液反复抽吸数次，直至裂解液变得澄清且均匀。将裂解液在4°C条件下轻轻旋转孵育1小时。之后，将裂解液用20倍体积的稀释缓冲液稀释，并分装至若干15毫升超滤管（截留分子量为10千道尔顿）中，每管15毫升。

使用摆桶式转子，在4000 × g、4°C条件下离心约15分钟，直至各组分浓缩至体积小于1毫升。向每份浓缩的裂解液组分中加入14毫升稀释缓冲液，并重复上述浓缩步骤。随后合并各组分，并使用前述浓缩方法将其进一步浓缩至6毫升体积。

首先，按照文本方案中所述配制反应混合液。将该反应混合液加入6毫升预清除的裂解液中，并充分混匀。再加入162.5 µL还原剂，并充分混匀。

在室温下，将样品置于转速为800 rpm的摇床上孵育两小时。随后加入终浓度为5毫摩尔的EDTA以终止反应，并在室温下继续于摇床上孵育5分钟。接着，将反应混合物等分至两个50毫升离心管中，每管加入四倍体积的预冷甲醇，于-30摄氏度孵育30分钟。

在4000 × g、4 °C条件下离心15分钟。弃去上清液，向沉淀中加入1至2毫升预冷的甲醇。用移液器上下吹打，使沉淀完全重悬，确保无可见团块残留。

重复离心和重悬过程两次。此后，小心尽可能吸出残留的甲醇，注意不要扰动沉淀。加入10毫升重建缓冲液，用移液器吹打数次以溶解沉淀。

在4000 × g、4°C条件下离心10分钟。然后将上清液转移至新管中，并确保收集20 µL样品用于质量控制。将纯化并重新溶解的样品转移至预先准备好的链霉亲和素琼脂糖珠中。

在4°C下轻轻旋转孵育过夜。在4000 × g下离心5分钟以沉淀微珠。将上清液转移至新管中，并确保收集20 µL样品用于质量控制。

用10毫升洗涤缓冲液A洗涤磁珠。在室温下以12 rpm的速度轻轻旋转孵育10分钟。然后在4000 ×g下离心5分钟使磁珠沉淀。弃去上清液，并重复洗涤和离心过程一次。

按照文本方案中所述，使用洗涤缓冲液B和洗涤缓冲液C重复此洗涤步骤。随后，用10毫升50毫摩尔的Tris盐酸缓冲液洗涤磁珠。在4000 ×g 条件下离心5分钟，沉淀磁珠。

移除上清液，并将磁珠均分至两个1.5 mL离心管中。为开始洗脱捕获的核糖核蛋白复合物（RNPs），向400 µL洗涤并沉淀后的磁珠中加入400 µL已配制的生物素洗脱缓冲液。在室温下以1500 rpm于摇床中孵育20分钟。

然后在振荡培养箱中，于65摄氏度、1500 rpm条件下孵育10分钟。将磁珠在7800 ×g条件下离心1分钟，收集洗脱的RNP。向磁珠中加入400 µL新鲜的生物素洗脱缓冲液。

重复孵育和离心步骤，收集第二次洗脱液，并将两次洗脱液合并至一个15毫升离心管中。随后，向合并的RNP洗脱液中加入三倍体积的稀释缓冲液，以降低SDS的浓度。使用0.5毫升超滤管，按照文本方案中的说明，将样品浓缩至约40微升。

加入0.5微克/微升的RNase A，37摄氏度孵育两小时，以释放与RNA交联的RNA结合蛋白（RBP）。取2微升RBP用于质量控制。在优化CARIC实验方案时，质量控制步骤至关重要。

通过凝胶内荧光分析对点击标记样品进行代表性质量控制。仅双标记样品在高分子量区域显示出明显的弥散条带，代表交联核糖核蛋白（RNP）的信号。若省略四种硫代尿苷（SU）或乙炔基尿苷（EU）中的任意一种，RNP信号均会消失。该信号也可通过RNase A消化而消除。在某些情况下，无四种硫代尿苷（SU）的对照样品中也可观察到明显的弥散条带。

该条带代表带有标记但未交联的核糖核酸酶，在大多数情况下会在加热变性过程中降解。通过蛋白质印迹分析对亲和沉淀数据的质量进行控制，检测沉淀前和沉淀后样品中的生物素信号。对捕获的RNA结合蛋白进行银染分析，结果显示，在HeLa细胞中，总体捕获效率占输入蛋白的0.05%至0.1%。

在进行该实验操作时，需注意RNase对核糖核酸酶敏感。应尽量保持实验环境清洁，以减少RNase的降解。完成本实验步骤后，可进行质谱分析以鉴定铁结合蛋白。

在该技术得到开发后，CARIC 技术将为更全面地理解转录后 O-GlcNAc 修饰调控机制提供新的途径。