利用双荧光素酶报告系统构建CRISPR质粒并检测哺乳动物细胞中的基因敲除效率

本方案描述了高效sgRNA载体构建与优化的关键步骤。我们对候选sgRNA靶点的相对时间进行了预加速及推断。本方案的主要优势在于，无需编辑内源性基因，即可分析每条sgRNA的DNA编码效应。

这种预筛选方法也可通过双链断裂应用于其他基因编辑技术。首先将冻干的寡核苷酸用双蒸水稀释至终浓度为10微摩尔。将正向和反向寡核苷酸以1:1的比例在薄壁PCR管中混合，无需添加任何额外缓冲液。

将混合物在 95 摄氏度孵育 5 分钟，然后将温度降至 72 摄氏度，继续孵育 10 分钟。从 PCR 仪中取出寡核苷酸混合物，并在室温下冷却。用 BbsI 消化 pX330-xCas9 载体时，在 50 µL 体积中将载体、酶和消化缓冲液混合，于 37 摄氏度孵育反应体系 2 小时。

完成细胞转化后，从LB平板上挑选5到10个细菌菌落，分别用每个菌落接种含有60毫克氨苄青霉素的1毫升LB培养基，置于1.5毫升离心管中。然后将离心管在摇床中振荡培养2至3小时。按照文稿中所述方法进行PCR筛选重组质粒，随后在10伏/厘米的电泳条件下，将PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离。

在鉴定出阳性质粒后，将其与报告载体共同转染适当的细胞系。裂解细胞时，移除培养细胞的生长培养基。用 PBS 轻轻洗涤培养容器表面，并向每个培养孔中加入 100 µL 裂解缓冲液（PLB），以完全覆盖细胞单层。

将培养板在室温下孵育20分钟，然后将裂解液转移至离心管或小瓶中，以进行后续操作或保存。为进行双荧光素酶检测，需设置化学发光仪，提供2秒的预读延迟，随后进行10秒的测量周期。然后，向适当数量的化学发光仪检测管中加入100 µL荧光素酶检测试剂。

小心地将 20 µL 细胞裂解液加入到发光仪检测管中，并用移液器吹打两到三次以混匀。将检测管放入发光仪中并开始读数。读数完成后，从发光仪中取出样品管。

加入100 µL终止试剂，短暂涡旋混匀。将样品放回化学发光仪，启动读数。记录海肾荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶活性为标准化依据，具体为屏幕上显示比值的倒数。

实验结束后丢弃反应管。本方法用于构建针对绵羊 DKK2 基因第1外显子的三个 sgRNA 载体。sgRNA 和 xCas9 表达载体的构建方法是：预先消化载体骨架，随后通过寡核苷酸对退火形成一系列短的双链 DNA 片段，并将这些片段连接到载体中。

通过特异性引物对引导的PCR方法筛选了七个细菌菌落，并检测到了阳性菌落。利用双荧光素酶报告基因检测系统，同时检测了pX330-xCas9 T1、T2和T3的基因靶向能力。最后的sgRNA载体显示出最高的检测信号，随后被用于绵羊基因编辑研究。

按照本实验方案，可进行T7EI检测或核糖核酸酶检测。这些额外步骤能够更准确地评估内源基因的编辑效果。