构建1型Streptococcus pneumoniae菌株519/43的突变体
2020年9月11日
本文描述了一种S. pneumoniae 1型菌株519/43，该菌株可通过其天然摄取DNA的能力以及自杀型质粒实现遗传修饰。作为原理验证，我们构建了肺炎溶素（ply）基因的同源突变株。
本方案具有重要意义，因为它实现了对一种此前难以进行遗传操作的血清型进行基因改造，从而使得研究人员能够深入探索并理解该血清型的特性。这为疫苗开发等生物学研究工作开辟了新的途径。本实验操作将由伦敦卫生与热带医学院的助理教授Vanessa S. Terra演示。
首先，按照pGEM-T Easy System I试剂盒的说明书进行连接反应，构建质粒pSD1。将连接反应在4°C孵育过夜。次日，将pSD1转化至化学感受态的大肠杆菌Dh5-alpha中，取50 µL菌液与3 µL pSD1连接产物在冰上孵育15分钟，随后进行热激处理，再将菌液放回冰上孵育2分钟。
将细胞从冰上取出，加入350微升SOC培养基，然后在37摄氏度、120转/分钟的条件下培养2小时。将转化产物涂布于添加了0.4毫摩尔IPTG、0.24毫克/毫升X-Gal（用于蓝白斑筛选）和100微克/毫升氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上，以确保平板上生长的所有菌落均含有质粒骨架。挑选三个含有pSD1的白色菌落，接种于10毫升添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基中，进行过夜培养。
将培养物在37摄氏度下振荡培养过夜。次日，在3,082 G条件下离心培养物，并用沉淀物进行质粒提取。提取质粒DNA后，对pSD1质粒和壮观霉素抗性盒均进行BamH1限制性酶切消化。
将限制性酶切反应及对照组在 37 摄氏度孵育三小时。酶切完成后，通过电泳分析产物，切下正确的条带，并使用商业试剂盒进行纯化。接下来，使用经 BamH1 消化的 pSD1 和链霉素进行连接反应。
这将生成质粒pSD2。按照之前所述方法，将pSD2转化至化学感受态的大肠杆菌DH5-alpha中。随后，根据转化子在添加了每毫升100微克壮观霉素和氨苄青霉素的LBA培养基中生长的能力筛选携带质粒pSD2的菌落，并提取质粒DNA。
在BHI培养基中制备肺炎链球菌519/43的过夜培养物，并于37°C及5%二氧化碳条件下静置培养。次日，将培养物用10毫升新鲜BHI肉汤按1:50和1:100比例稀释。于37°C静置培养，直至在595纳米处的光密度（OD）达到0.05至0.1之间。
当达到合适的OD值后，取860微升培养物转移至微量离心管中。加入100微升100毫摩尔/升的氢氧化钠、10微升20% BSA、10微升100毫摩尔/升的氯化钙、2微升50纳克/毫升的CSP1以及500纳克的pSD2。将反应体系在37摄氏度下静置孵育3小时。
随后，在3小时的孵育期间内，每隔一小时将330微升样品接种至补充了100微克/毫升壮观霉素的5%血琼脂平板上。然后，将平板在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜孵育。挑取具有壮观霉素抗性的菌落，转接到另一块补充了100微克/毫升壮观霉素的血琼脂平板上，以及补充了100微克/毫升氨苄青霉素的血琼脂平板上，后者用于检测质粒骨架的存在。
将两组培养皿过夜孵育。通过限制性酶切确认pSD2的正确组装。随后利用pSD2转化519.43野生型细胞。
在含有链霉素的培养基上经 overnight 培养后生长的菌落被视为阳性转化子。通过检测 D39、519/43 野生型及 519/43 Δply 突变株的溶血活性，对肺炎溶素突变进行表型验证。同时以 0.5% 皂苷对红细胞的溶血作用作为 100% 溶血对照。该突变株丧失了裂解红细胞的能力。
所有阳性克隆均通过测序进一步确认，以评估插入位点的位置。使用结合位点位于同源区域外的引物。进行转化反应时，按正确顺序添加试剂至关重要。
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概述
本文介绍了一种利用肺炎链球菌（S. pneumoniae）血清型1菌株519/43天然摄取DNA的能力对其进行遗传修饰的方法。该研究展示了在肺炎溶素（ply）基因中构建同源突变体的过程，为后续研究奠定了基础。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因工程
- 病原体研究
背景
- 肺炎链球菌是一种重要的人类病原体。
- 对该血清型进行遗传修饰一直具有挑战性。
- 了解其遗传特性有助于疫苗研发。
- 本研究提供了一种新的遗传操作方法。
研究目的
- 实现对1型肺炎链球菌的遗传改造。
- 构建用于科研目的的突变菌株。
- 促进对肺炎溶素及其在致病过程中作用的研究。
使用的方法
- 使用 pGEM-T Easy System I 构建质粒 pSD1。
- 将连接反应产物转化至大肠杆菌 Dh5-alpha 中。
- 感受态细胞的孵育及热激处理步骤。
- 通过标准分子生物学技术验证基因修饰结果。
主要结果
- 成功构建ply基因的同基因突变体。
- 验证了该实验方案在基因修饰中的有效性。
- 对疫苗研究与开发具有潜在意义。
- 建立了研究肺炎链球菌（S. pneumoniae）的新模型。
结论
- 该方法实现了对一种 previously 难以操作的血清型进行遗传学改造。
- 这为生物学研究开辟了新的途径。
- 后续研究可利用该技术推进疫苗开发。
常见问题
行业重要性概述
肺炎链球菌1型的基因改造在传染病研究中长期存在障碍，特别是在高疾病负担地区的疫苗和治疗靶点验证方面。本方案可在临床相关菌株中实现功能基因组学研究，支持对肺炎溶素等毒力因子进行机制性风险降低。通过建立可靠的诱变系统，可提高靶点选择的预测可信度，并加速临床前评估流程。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在具有临床相关性的血清型中构建同基因突变体，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供可重复的系统，用于对如ply等毒力基因进行功能验证。
- 战略价值：通过在感染模型中将基因型与表型关联，支持靶点的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成明确的突变菌株，用于标准化的表型分析，包括溶血和感染模型。
- 操作价值：建立用于生成同基因型对照菌株的工作流程，这对实验可重复性至关重要。
- 战略价值：利用可选择标记和反向筛选实现遗传变异体的可扩展筛选。
转化与临床前研究
- 科学价值：利用腹腔和鼻内攻击模型，在体内实现表型与基因型的相关性分析。
- 操作价值：制备经过验证的突变株库存，用于后续有效性与安全性测试。
- 战略价值：揭示血清型特异性的致病机制，为决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于发现生物学阶段，可在先导化合物筛选之前，通过基因操作实现靶点验证。
- 发现生物学：支持基于假设的基因敲除，以阐明通路在发病机制中的作用。
- 筛选：生成同基因型突变体组合，用于在细胞和动物模型中进行比较表型筛选。
- 分析：实现对溶血活性和组织中细菌载量等依赖性变量的定量测量。
- 转化研究：通过比较不同血清型的感染表型，将分子发现与临床前结果相联系。
- 企业级复用：建立可适用于其他疫苗候选抗原的连续诱变技术平台。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低血清型特异性致病机制中的机理性模糊性，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：提供一种标准化、可重复的方法，用于在肺炎链球菌（S. pneumoniae）中生成特定的基因突变体。
- 战略价值：通过实现对靶点必需性和毒力贡献的早期评估，优化研发管线的优先级排序。
- 研发管线影响：在投入高昂的临床前研究之前，提供关于毒力因子的功能性数据，支持基于风险评估的推进决策。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆、细菌转化和等位基因交换技术方面的专业知识。
- 依赖于能够使用电穿孔或化学转化系统对大肠杆菌（E. coli）和肺炎链球菌（S. pneumoniae）进行转化的条件。
- 需要标准化的DNA制备、限制性酶切和连接方案，以确保质粒的完整性。
- 操作致病性肺炎链球菌（S. pneumoniae）菌株时，需在生物安全二级（BSL-2）条件下进行。
- 实验成功取决于感受态诱导条件的优化，包括感受态刺激肽1（CSP1）浓度和氯化钙水平。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
