使用免疫RNA-荧光原位杂交技术可视化SARS-CoV-2

该方案使得在细胞系以及完全分化的三维人呼吸道上皮培养物中可视化SARS-CoV-2 RNA成为可能，为在单细胞水平上更好地理解病毒的致病机制和复制过程提供了一种工具。由于其高特异性、高灵敏度和高分辨率，该方法不仅适用于SARS-冠状病毒-2的基础科学研究，也适用于诊断等应用型项目。本实验操作将由我实验室的博士生Agnieszka Suder进行演示。

按照文稿中所述对细胞进行固定和通透处理后，从各孔中移除1X PBS溶液，并向每孔加入至少300微升扩增缓冲液。将样品在室温下孵育30分钟。通过在独立的离心管中对所需体积的HCR发卡探针进行快速冷却，分别进行预处理。

配制300微升扩增溶液时，使用每种发夹结构18皮摩尔。将发夹溶液转移至离心管中，在95摄氏度孵育90秒，然后在避光条件下冷却至室温，持续30分钟。

通过将瞬时冷却的H1和H2发夹结构加入扩增缓冲液中，制备发夹混合物。将30至50微升的发夹混合物滴加到Parafilm上。将带有细胞的盖玻片放置在发夹混合物液滴上，并在室温避光条件下孵育样品过夜。

封片时，在载玻片上放置两滴10微升的封片剂，确保两滴之间留有足够距离，以便在同一张载玻片上放置两个盖玻片。将盖玻片在干净的纸巾上轻压，去除多余液体。然后将其放入抗荧光淬灭封片剂中，使细胞面朝下。

将固定的样品置于干燥、平坦的表面，在避光条件下使其固化。按照文本稿件中的描述对HAE细胞进行固定和通透处理后，将样品与扩增缓冲液在室温下孵育30分钟，进行预扩增。每种发夹探针使用30皮摩尔，用以配制500微升的扩增溶液。

将发夹结构溶液转移至离心管中，在95摄氏度孵育90秒，随后在避光条件下冷却至室温，持续30分钟。通过将所有快速冷却的发夹结构加入500 µL室温的扩增缓冲液中，制备发夹结构溶液。

移除预扩增溶液，加入完整的发夹结构溶液。然后将样品在室温避光条件下孵育过夜。将Transwell小室中切下的膜置于10微升抗荧光淬灭封片剂上，细胞面朝上，并向膜上添加额外的封片剂。

然后用盖玻片覆盖膜。该免疫RNA-FISH方案在两种细胞系统中进行，分别为Vero细胞系和三维人呼吸道上皮培养物。此处展示了SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA在感染和模拟接种的Vero细胞中的定位。

病毒RNA显示为红色。此处展示了感染和模拟接种的人气道上皮细胞中SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA的定位。该透化方案在Vero细胞中进行了优化。

使用去垢剂进行通透化处理可获得清晰且特异的SARS-冠状病毒-2亚基因组RNA信号，而使用乙醇则会导致图像模糊、不聚焦。在封片含有Vero细胞的载玻片时，应将盖玻片上的细胞面朝下放置。而在封片HAE载玻片时，需将膜上的细胞面朝上放置。

该技术可轻松改造，用于检测任何RNA，包括非编码RNA以及未来可能出现的RNA病毒。与免疫荧光结合后，可用于在单细胞水平上研究蛋白质-RNA相互作用。