通过BiFC-FRET-FLIM检测法测定MADS-box转录因子两个单体与钙感受蛋白之间的三元相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用的研究有助于理解多种生物过程的调控机制。本文中，我们演示了一种由 Y John Shoe 及其同事于 2007 年首次描述的实验方法，该方法结合了双分子荧光互补（BiFC）与荧光共振能量转移（FRET），用于验证三个蛋白质分子之间的三元相互作用。

然而，我们在本实验流程中加入了荧光寿命测定，以验证FRET测量结果。为了证明三元相互作用，我们选择了一种已知能够形成同源二聚体的蛋白质。此外，该蛋白质在本实验室中也已验证可与一种被称为C蛋白的钙感应蛋白相互作用。

MNC蛋白在细胞质中相互作用。该技术中，两种蛋白分别与分裂的YFP蛋白标记。它们的相互作用导致功能性YFP的恢复，后者作为FRET受体，与第三种相互作用蛋白（标记有作为FRET供体的CFP）之间发生荧光共振能量转移（FRET）。

首先通过 PCR 扩增目的基因的编码序列，在本例中为 M 基因和 C 基因，并将其克隆至合适的入门载体中。通过限制性酶切和 DNA 测序，对在含抗生素的平板上筛选出的克隆进行验证。将重组的编码序列从入门克隆转移至目的载体中。

本实验中使用的所有载体均列于表一中。最后，通过电穿孔法将目的载体转化至农杆菌GV3101细胞中。本实验中，我们在人工气候室的受控条件下培养处于四到六叶期的本氏烟（Nicotiana Benthamiana）植株。

按 2:1:1 的比例混合土壤基质、椰糠和堆肥，配制土壤混合物。在塑料托盘中铺一层约一英寸厚的混合物以形成苗床，并用少量水充分润湿。将约 200 粒种子均匀撒在土壤表面，然后将托盘放入较大的托盘中，使底部接触约一厘米深的静水。

用塑料薄膜覆盖此托盘以创建保湿室。将该托盘转移至设定为23°C、光照16小时/黑暗8小时循环的培养室中。两周后，将幼苗移栽至装有饱和水土壤混合物的小型3至4英寸花盆中。

将这些花盆放入塑料托盘中，并转移至生长室中继续培养四周。进行农杆菌浸润实验时，需将农杆菌菌株新鲜转接培养，并按适当比例与P19菌株混合。该操作步骤首先从划线平板上接种含有BiFC和FRET载体的GV3101农杆菌菌株至10 ml液体培养基中开始。

加入含有适当抗生素的液体培养基中。同时，接种农杆菌P19菌株进行培养，以防止外源基因沉默。用铝箔纸封住锥形瓶，并置于摇床培养箱中，在28摄氏度、170转/分钟的条件下培养16小时。

过夜培养后，取1 ml上述菌液转移至一次性比色杯中，使用分光光度计在600纳米波长下测定光密度。将含有相应BiFC和FRET配对组分的菌株菌液混合，使终浓度OD值为0.5，P19的OD值为0.3，总体积为2 ml。

为达到这些比例，我们遵循屏幕上显示的公式进行计算。将混合的农杆菌培养物在室温下以3000G离心5分钟，并小心弃去上清液。将菌体沉淀重悬于2 ml中。

浸润缓冲液。可能需要使用涡旋振荡器将细胞完全重悬，形成均匀的细胞悬液。此后，将离心管于室温避光孵育三小时。

同时，为每个植物花盆标记将要浸润的质粒组合。用去针头的1 ml注射器吸取农杆菌混合液。

轻轻但稳固地将注射器尖端压在完全展开叶片的远轴面，同时用另一只手从近轴面支撑叶片。缓慢推动活塞，直至溶液渗透至相当于注射器尖端面积两到三倍的叶片区域。每片叶上最多选择四个位点进行细菌混合液的渗透，每种渗透处理重复操作三到四片叶片。

此外，每种构建体至少包含两株植物进行侵染。请记得用70%酒精擦拭双手或更换手套，以防止任何交叉污染。将所有花盆转移至托盘中，并在相同的生长条件下于培养室中孵育。

使用荧光显微镜检测农杆菌浸润叶片的一小部分。当在细胞中可检测到YFP和CFP的荧光时，继续进行共聚焦显微镜下的BiFC FRET-FLIM分析。在本实验中，该分析在农杆菌浸润后三天进行。

现在，植物已准备好在显微镜下观察，从距注射器针头伤口5至8 mm处切取方形叶片样本，并将其置于蒸馏水中。盖上洁净的盖玻片并封片。

在共聚焦激光扫描显微镜下观察这些样品。本实验中，确定并量化两种蛋白质之间相互作用的基础是：当FRET供体与其受体相互作用时，供体的荧光寿命会降低，该变化可用于计算FRET效率。在三元相互作用的情况下，复杂性进一步增加，因为此时的FRET受体并非单一分子，而是一对分裂的YFP BiFC蛋白；该对蛋白需首先在体内重新组装，才能形成功能性的FRET受体荧光基团。

为了进行FRET-FLIM实验，我们首先需要测定供体分子的荧光寿命，先单独测定供体分子，然后在存在FRET受体的情况下进行测定。在共聚焦激光扫描显微镜中打开FLIM应用程序，启动控制台，并使用模式识别光子计数法来测量荧光寿命。选择标准的全光子计数测量模式。

我们将采用两种农杆菌浸润的植物样本：一种含有CCFP基因，另一种同时含有CCFP和MYFP基因。由于M蛋白与C蛋白之间的相互作用已通过BiFC和Y2H实验得到验证，因此我们预期该相互作用配对能够产生较高的FRET效率。首先，我们扫描CCFP农杆菌浸润的叶片，寻找表现出良好CFP荧光的细胞。

显微镜的设置显示在屏幕上。使用足够的激光功率照射样品，以实现每个脉冲约0.1个光子。对于荧光强度可变的样品，我们将采集50帧图像，以收集寿命测量所需的足够光子。

由于已知CFP会因其构象适应而表现出两种荧光寿命，我们采用指数再卷积模型输入数据，并将N值保持为2。在此设置下，两种寿命分别出现在1纳秒和3.2纳秒。在所有后续计算中，我们将使用较长的寿命值。

现在我们准备测量 CCFP 与 MYFP 之间的荧光共振能量转移（FRET）。为此，请使用经农杆菌浸润并表达 CCFP 和 MYFP 的植物叶片样本。寻找一个同时表达 CCFP 和 MYFP 的细胞，并通过使用完整的 40 纳米脉冲激光和 514 纳米白光激光激发，确认它们各自的发射模式。

随后，我们切换到 FLIM 控制台，使用之前测量 CCFP 寿命时相同的设置来测量 CFP 的寿命。但这一次，细胞还表达了可能与 CCFP 相互作用并导致 CCFP 寿命缩短的 MYFP。正如我们从使用 N 等于 2 的 N 指数反卷积模型获得的图中所读取的，CFP 的寿命确实从 3.2 纳秒减少到了 2.6 纳秒。

现在我们在软件中启动FRET控制台，并通过在软件提供的方程中手动输入确定的寿命值来计算FRET效率，测得的FRET效率为56%。接下来进入最后一步，即可视化三个组分之间的相互作用。为此，我们取用共浸润了CCFP以及MYFPN与MYFPC的植物叶片样本，对叶片中的细胞进行扫描，寻找同时显示CFP信号和由两种M蛋白相互作用所重构的YFP荧光信号的细胞。

我们使用与之前相同的激光和发射波长。随后，关闭 514 纳米激光器，并切换至 FLIM 控制台。如果 MYFP 二聚体与 CCFP 相互作用。

我们应观察到CCFP的寿命在其与MYFP相互作用时缩短。然而，如果CCFP未能与MYFP二聚体发生相互作用，其荧光寿命应仍保持在3.2纳秒。采用与上述类似的设置，我们测量在重组YFP存在条件下CFP的寿命。

我们使用双指数重卷积模型对图形进行拟合，其中指数项数量 a 等于 2，然后进入 FRET 分析界面。可以看到，CFP 的荧光寿命确实从 3.2 纳秒下降到了 2.3 纳秒。随后，我们根据上文所述方法计算 FRET 效率。

计算得到的FRET效率为55%。在此，我们利用FLIM测量了在有和无FRET受体存在的情况下，FRET供体伴侣的荧光寿命。如果两种蛋白质之间存在正向相互作用，则预期供体的荧光寿命会降低。以阳性对照为例，即CCFP和MYFP。

我们观察到供体的荧光寿命从 3.3 纳秒减少至 2.5 纳秒，FRET 效率为 56%。在重建的 YFP 中进行类似的实验，由两个 a 单体与 C 蛋白之间的相互作用也产生了阳性 FRET 相互作用，导致供体的荧光寿命减少至 2.6 纳秒。在此情况下，计算得到的 FRET 效率约为 55%。FRET 供体荧光寿命的减少为这些蛋白之间存在三元相互作用提供了有力证据。

本文所述方案是一种用于确定活细胞中三元蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具。该方法还可帮助确定所形成复合物的细胞内定位，这对于解析任何蛋白质复合物的功能及其生理意义至关重要。总之，基于BiFC的FRET-FLIM检测技术为研究和表征三元蛋白质相互作用的重要特征提供了机会，在动物和植物系统中的蛋白质-蛋白质相互作用研究中均具有重要应用价值。