使用拉曼染料进行高重组织成像

高度多重化的振动成像提供了一种单次光学方法，可对组织中多个蛋白质标志物进行亚细胞分辨率的检测。该平台能够全面呈现生物系统中蛋白质相互作用的图景。该技术的主要优势在于其无需循环的多重检测能力。

该技术特别适用于循环策略效果不佳的应用场景，例如厚组织切片。此方法能够对单个细胞进行原位表征，以帮助理解复杂系统的结构，如构建组织图谱、表征肿瘤微环境以及解析脑环路。首先，配制浓度约为 0.1 摩尔的碳酸氢钠 PBS 缓冲液，pH 调至 8.3，用作偶联缓冲液，并于 4 摄氏度保存。

然后在无水二甲基亚砜中配制3毫摩尔的N-羟基琥珀酰亚胺酯功能化MARS探针溶液。将抗体固体溶解于偶联缓冲液中，使其浓度达到每毫升2毫克。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，先使用离心过滤器进行浓缩，再加入偶联缓冲液，使其浓度达到每毫升1至2毫克。

为了进行二抗的偶联反应，将染料溶液以15倍摩尔过量的比例缓慢加入玻璃小瓶中的抗体溶液中，同时搅拌，并在室温下继续搅拌孵育反应混合物1小时。为进行纯化，取10毫升凝胶过滤树脂粉末加入50毫升离心管中的40毫升PBS缓冲液中，配制成悬浊液。将该溶液置于90摄氏度水浴中保温1小时。

然后倾去上清液，加入 PBS 至 40 毫升，将悬液于 4 摄氏度保存。用悬液溶液装填尺寸排阻层析柱至 10 至 15 厘米高度，随后用约 10 毫升 PBS 冲洗并洗涤层析柱，以进一步压实树脂。接着，用移液器将偶联反应混合物加至层析柱中。

加入反应混合物后，立即加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）作为洗脱缓冲液。随后，通过观察柱上的颜色或在280纳米处测定吸光度来收集偶联溶液的洗脱液。使用离心过滤器将收集的溶液浓缩至每毫升一至二毫克。

使用疏水性笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。随后将组织与0.3%至0.5% PBST孵育10分钟，并用封闭缓冲液孵育30分钟。配制一抗染色液时，将所有一抗按所需浓度加入200至500微升染色缓冲液中。

若出现沉淀，将一抗染色液在13,000 × g条件下离心5分钟，并使用上清液。然后将组织在4°C下于一抗溶液中孵育1至2天。在室温下，用0.3%至0.5% PBST在切片架中洗涤切片3次，每次5分钟，并确保组织完全浸没于溶液中。

随后，将组织在 200 至 500 微升封闭缓冲液中孵育 30 分钟。为配制二抗染色液，将所有二抗按所需浓度加入 200 至 500 毫升染色缓冲液中。然后以 13,000 × g 离心 5 分钟，若出现沉淀，则使用上清液。

接着，将组织在 200 至 500 微升二抗溶液中于 4 摄氏度孵育 1 至 2 天。然后在室温下用 0.3% 至 0.5% PBST 洗涤切片两次，每次 5 分钟。随后加入 200 至 500 微升 DAPI 溶液孵育 30 分钟。

再次于室温下用 PBS 洗涤载玻片三次，每次五分钟，并用玻璃滴管将漂浮的组织切片转移至玻璃载玻片上。用组织刷将组织展开，必要时用擦拭纸清洁周围区域。随后，在组织上滴加抗荧光淬灭封片试剂，盖上玻璃盖玻片并用指甲油封固。

进行多通道-eprSRS成像时，在激光控制面板上将泵浦光束的激光功率设置为10至40毫瓦，斯托克斯光束的激光功率设置为40至80毫瓦。然后在显微镜软件中将像素驻留时间设置为2至4微秒，并采用多帧平均，通常为10至20帧。此外，将锁相放大器的时间常数设置为像素驻留时间的一半。

通过免疫标记法对不同蛋白质标志物、HeLa细胞、经多聚甲醛固定的鼠脑皮层以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的湿润肾脏组织进行拉曼染料成像。利用α-微管蛋白对HeLa细胞进行增强型受激拉曼散射（eprSRS）成像，揭示了微管等精细的亚细胞结构。对经MARS 2145染色的星形胶质细胞和经MARS 2228染色的小脑颗粒神经元进行eprSRS成像，展示了具有亚细胞分辨率的三维分布模式。

对冷冻的小鼠胰岛组织进行了七色SRS荧光串联成像，以检测激素和转录因子。所获得的图像显示出良好的对比度和正确的分布模式。对多聚甲醛固定的鼠小脑组织进行了八色SRS荧光串联成像，以检测细胞类型标志物。

鉴定了多种类型的细胞，如小脑颗粒神经元、浦肯野神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及GABA能神经元。该方法可进一步与组织透明化技术联用，以实现对厚而完整的组织进行高重蛋白成像。本课题组已为此开发了一种针对拉曼染料优化的组织透明化方案。