利用光镊与离焦显微技术对红细胞黏弹性性质的定量分析

该方法可用于研究红细胞在多种生理和病理条件下的力学行为，表征其黏弹性参数及软玻璃态特性。我们基于单细胞的方法通过使用形态因子的金属值来验证视频参考，该形态因子关联了作用力与位移，以及红细胞表面的应力与剪切力。首先将硅脂均匀涂抹在橡胶环表面，确保覆盖整个周长。

接下来，将橡胶环放置在盖玻片上，涂有润滑脂的一面朝向盖玻片。静置五分钟以确保牢固粘附，此时样品支架即可用于接种细胞培养。随后，取按照书面实验方案预先配制好的细胞悬液，将细胞接种至样品支架中。

向样品中加入 0.2 µL 的 10%（体积比）聚苯乙烯微球溶液。将第二块盖玻片置于橡胶圈上方。封闭装置，完成样品制备。

最后，将整个样品转移至显微镜下。开始实验时，使用光镊系统，用光镊激光捕获微球，并将其固定在盖玻片上，靠近细胞的位置。然后捕获另一个微球，重复相同的固定步骤，将微球压向细胞表面，位置靠近细胞顶部表面且接近细胞边缘处。

添加一个具有特定振幅和不同频率的正弦函数。接着，按下“开始”按钮，利用压电位移台实现压电位移。将红细胞微球固定在光镊中，并使用先前设定的正弦函数对样品施加一个运动循环。

进行分析时，打开 ImageJ 软件并导入正弦运动期间获得的整段视频。点击调整，然后选择阈值选项。通过两个滚动条调节阈值，并通过点击文件，随后选择矩形，来选定参考球体。

然后在“分析”选项卡中，点击“设置测量”并选择“质心”选项。再次点击“分析”选项卡并选择“分析颗粒”。此时将出现一个新窗口，其中包含质心 xy 坐标的表格。

对红细胞表面附着的另一个球体重复上述操作。打开分析软件并导入先前获得的 txt 文件。生成一幅以质心为纵轴（y 轴）、时间为横轴（x 轴）的图表。

使用横轴表示损耗常数（记为 K''），纵轴表示储能常数（记为 K'），将结果绘制成图。首先，进行视频采集时，通过软件控制压电平台在 xy 方向移动，寻找附着在盖玻片上的孤立细胞。捕获并附着一个已知直径的聚苯乙烯微球至红细胞表面。

接下来，使用压电载物台移动附着在红细胞表面的被捕获微珠，以使细胞发生形变，然后将微珠固定在盖玻片上。现在，调整 z 轴位置以找到清晰对焦的图像。固定位置后，使用相机软件拍摄整个细胞的视频。

然后，将 z 轴位置向下或向上移动两微米，以获取所选细胞的离焦图像。最后，在不改变 z 轴位置的情况下，寻找一个无细胞的区域，重复相同操作，并创建图像背景的视频。对于对比度图像的采集，首先找到 N 零的值，点击多边形选择图标，然后点击分析选项卡并选择测量。

接下来，使用对比度公式计算 N 图像 减去 N 零值，并通过在“处理”下选择“数学”功能，然后执行减法操作来完成该步骤。随后，将结果除以 N 零值 减去 B。最后，求出聚焦图像和离焦图像的对比度。现在，使用哈特利变换来获得红细胞厚度。

在 ImageJ 中，依次点击 process（处理）、FFT 和 FFT options（FFT 选项），然后选择 FHT。接着通过依次选择 process（处理）、FFT 和 FFT，执行逆变换 FHT。使用得到的图像获取高度轮廓。

找到包含红细胞高度轮廓的图像后，利用两个微米级离焦对比度在 ImageJ 中生成一组两幅图像。为获得形态因子，使用 ImageJ 自定义宏来分析该图像栈。该宏将输出一个表格，其中包含边缘位置、周长、周长的倒数，以及被分析细胞的图像。

检查该图像的边缘是否与参考图的边缘相似。否则，重复该步骤，并利用周长倒数之和计算形态因子。首先将实验数据整理成表格。

在分析软件中，单击文件选项卡以创建一个新表格。为参数确定10个不同的列。要在分析软件中绘制G′和G″曲线，请使用上一个表格中的数据，然后单击绘图按钮。

为获得参数 Gamma 和 GM，单击曲线拟合选项卡并选择 fit1 以打开新窗口。选中方框，单击 define 按钮，然后输入方程。依次单击两个窗口中的 okay 按钮，拟合结果即会显示。

接下来，创建另外两个图，即 G′ 和 G″ 随 ω 变化的函数图。仅在 y 轴上添加误差棒，方法与之前所示相同。重复曲线拟合过程，选择 G″ 选项。

在“常规拟合”下点击曲线定义，然后写出相关方程。最后点击确定，将出现一条拟合曲线以及 Alpha 和 G zero 的数值。再次执行另一条曲线拟合步骤。

选择 G"选项，点击“常规拟合”下的曲线定义，然后输入相关方程。最后点击确定，即可显示曲线拟合结果。该图显示了储能弹性常数随损耗弹性常数的变化关系。

观察到的线性依赖关系表明，红细胞表面可被视为一种软玻璃态材料。通过应用整体细胞形状因子和红细胞表面厚度的数值，可确定指数Alpha的数值。该技术可能为新型诊断方法提供基础，将红细胞黏弹性性质的变化与患有不同病理个体的血流改变相关联。