基于多胺的自组装肽两亲分子（PPAs）及相关生物材料的简便合成方案
2018年6月25日
由于多胺类化合物含有多个氨基氮原子，因此基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的合成具有较大挑战性，需要审慎使用保护基团来屏蔽这些活性官能团。本文中，我们描述了一种制备这类新型自组装分子的简便方法。
该方法可以解答关于如何将两亲性肽修饰到多胺上，以及八面体保护基团使用的若干关键问题。该技术的主要优势在于，能够利用含有多个反应性位点的未保护化学构建单元，生成杂化两亲性肽。演示该实验步骤的是来自康达·谢里丹实验室的实验室学生Mehdi、Nathalia和Krishnaiah。首先，精确称取2-氯三苯甲基氯树脂，将树脂置于容量为50毫升、带有砂芯且孔隙度中等的合成反应器中。
接下来，将合成容器固定在可调速机械振荡器上，并将容器倾斜至45度角，以最大程度地增强振荡效果。然后向树脂中加入15毫升二氯甲烷（DCM）。在树脂珠充分溶胀15分钟后，向树脂中加入八当量的目标多胺，并使其反应五小时。
反应五小时后，进行凯撒试验（kaiser test），以确认多胺与树脂的反应成功。随后，在无水甲醇中加入四当量的DDE，保护伯胺基团，并将反应混合物震荡过夜。次日，再次进行凯撒试验，若树脂珠无蓝色出现，则表明保护成功。
然后，沥干二氯甲烷，并用二氯甲烷与 DMF 的 2:1 混合液洗涤树脂两次。接着，向树脂中加入 20 当量溶于二氯甲烷的 Boc 酐，反应持续三小时。通过氯醌试验确认仲胺保护完成后，沥干溶剂混合物，并再次用二氯甲烷与 DMF 的 2:1 混合液洗涤树脂两次。
随后，向树脂中加入 10 毫升含 2% 肼的 DMF 溶液。振荡反应一小时后，进行凯氏试验（Kaiser test），以确认伯胺成功脱保护。接下来，加入四当量的 Fmoc 保护氨基酸、3.95 当量的 HBTU 以及 15 当量的 DIPEA，混合均匀。
加入等体积的二氯甲烷（DCM）和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）混合溶剂，并超声处理反应液直至完全溶解。在将混合物加入树脂之前，确保氨基酸、偶联试剂和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）充分混合并充分活化。等待三至五分钟以确保羧基完全活化后，将反应混合物加入含有树脂的反应容器中，在室温下反应两至四小时。
每一步均需进行凯撒尔（Kaiser）试验或氯醌试验，以确认偶联反应成功。在进行凯撒尔试验确认偶联成功后，加入10毫升含20% 4-甲基吡啶的DMF溶液，以脱除氨基酸的Fmoc保护基团。反应完成后，再次进行凯撒尔试验，以确认氨基酸的脱保护反应成功。
然后，每次用10毫升DMF洗涤树脂，共洗涤两次，每次持续5分钟，最后用10毫升DCM洗涤10分钟。在所有所需氨基酸偶联完成后，通过向9.5当量的HBTU和12当量的DIPEA中加入10当量的目标羧酸官能团，将疏水尾部与最后一个氨基酸偶联。将混合物超声至完全溶解，然后将该混合液加入反应容器中。
反应至少进行五小时，但建议过夜反应以获得最高产率。先用8 mL二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂2分钟，再用8 mL二氯甲烷（DCM）洗涤两次，每次5分钟。每次添加洗涤液前，需将容器中的溶剂排尽。
最后一次洗涤完成后，在真空条件下干燥树脂15分钟。准备15毫升裂解液时，将14毫升三氟乙酸（TFA）加入0.5毫升水和0.5毫升三异丙基硅烷中。将此裂解液加入树脂中，在室温下振荡反应2至4小时。
裂解反应完成后，将溶液收集至50毫升圆底烧瓶中。然后，在减压条件下，使用旋转蒸发仪于40摄氏度加热，将三氟乙酸（TFA）浓缩至1至2毫升。蒸发完成后，将所得的TFA溶液逐滴加入另一个含有15毫升无水冷乙醚的圆底烧瓶中，以沉淀PPA。接着，向盛有浓缩TFA溶液的原烧瓶中加入5毫升无水冷乙醚。
超声处理以回收更多固体。然后，将其与上一步骤中的乙醚溶液合并。盖住烧瓶，并将其放入冰箱中过夜，以最大程度促进沉淀。
第二天，使用细孔或中等孔径的中心圆盘滤器漏斗通过真空过滤收集沉淀物。最后，用五到十毫升冷乙醚将沉淀物洗涤两次，以去除任何残留的有机物。HPLC 谱图和 MALDI 谱图证实了 PPA 产物的存在，其纯度应高于 95%，可用于材料表征或生物学评价。
在基于紫外的高效液相色谱图谱中观察到单一尖锐峰，基质辅助激光解吸电离质谱图显示的分子量与计算得到的PPA分子量在正负一个道尔顿范围内相符。PPA的自组装可通过透射电子显微镜、原子力显微镜、小角X射线散射、扫描电子显微镜和动态光散射进行观察和分析。成功的自组装将在透射电子显微镜和原子力显微镜下形成结构明确的纳米结构。
一旦掌握，若操作得当，该方案可在三天内完成。在实施该步骤时，请务必在进行任何后续研究之前纯化产物并评估其纯度。按照此方案，还可制备其他分子，如肽两亲分子、肽以及肽-多胺杂合物。
该技术开发后，有助于自组装多肽两亲分子领域的研究，探索聚胺纳米结构在药物递送、成像或催化等领域的应用。观看本视频后，您应能充分理解如何开展基于聚胺的多肽两亲分子及其相关多肽两亲分子的合成。三氟乙酸和4-甲基吡啶可能具有危害性，在操作本实验步骤时应采取佩戴手套、实验服并在通风橱中操作等防护措施。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种合成基于多胺的肽两亲分子（PPAs）的方法，解决了多个反应性胺氮带来的挑战。该技术能够利用未保护的化学构建单元制备杂化肽两亲分子。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 有机化学
- 材料科学
背景
- 基于多胺的肽两亲分子在多种应用中具有重要意义。
- 多个胺基氮原子使其合成过程复杂化。
- 通常使用保护基团来屏蔽反应性官能团。
- 需要开发新方法以简化合成过程。
研究目的
- 建立一种简便的PPA合成方法。
- 探索多胺修饰肽两亲分子的策略。
- 有效利用八元环保护基团。
使用的方法
- 称量2-氯三苯甲基氯树脂。
- 使用带砂芯的合成反应容器，以二氯甲烷（DCM）溶胀树脂。
- 将树脂与多胺反应5小时。
- 采用可调速机械振荡器进行搅拌。
主要结果
- 该方法成功合成了杂化肽两亲分子。
- 可使用未保护的化学砌块。
- 该技术在合成中表现出显著优势。
- 实验室学生能够有效执行该操作步骤。
结论
- 该方法简化了基于多胺的肽两亲分子的合成。
- 它为自组装分子的研究开辟了新的途径。
- 未来的研究可在此技术基础上拓展多种应用。
常见问题
行业重要性概述
基于多胺的肽两亲分子（PPAs）为设计具有可调纳米结构的自组装生物材料提供了一个模块化平台，在药物递送、成像和催化等领域具有应用价值。本合成方案能够快速、可重复地获得具有多种形貌的杂合两亲分子，支持早期材料创新及转化研究。该方法解决了关键的合成难题，有助于拓展以生物材料为核心的研发布局。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够系统性地探索多胺修饰在肽两亲性支架上的功能材料设计。
- 通过可控地修饰亲水和疏水区域，支持机制层面的风险降低。
- 促进纳米结构的快速原型构建，用于基于假设的材料筛选。
筛选与检测方法开发
- 提供高纯度（>95%）的两亲性分子，适用于后续生物学评价和检测整合。
- 标准化合成与纯化步骤，提高不同批次及研究间的可重复性。
- 生成经HPLC、MALDI和显微镜验证的结构明确的纳米结构，支持定量检测方法的开发。
转化与临床前研究
- 可制备具有定制形态的生物材料，用于药物递送或成像的临床前研究。
- 为在与疾病相关的系统中评估结构-功能关系提供平台。
- 当与转化目标一致时，支持从材料合成到体外和体内表征的连续性研究。
流程与工作流整合
该方案将PPA合成置于早期发现与临床前材料评价的交汇点，从而实现迭代设计和材料的快速鉴定。
- 发现生物学：促进对多胺修饰在自组装和功能中作用的假设验证。
- 筛选：提供可重复且高纯度的两亲分子，用于可靠的化合物评估和检测准备。
- 分析：整合高效液相色谱（HPLC）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）和显微镜技术，对产物的结构特征和形貌进行定量评估。
- 转化研究：在相关情况下，为临床前模型中的生物材料优化奠定基础。
- 企业级复用：该方案可适用于相关的肽两亲分子及杂合系统，支持平台的可扩展性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过实现精确的结构控制，提高材料性能预测的可信度。
- 操作价值：简化合成、纯化和验证过程，提升研发流程效率。
- 战略价值：加快对新型生物材料候选物的立项或淘汰决策，降低后期开发风险。
- 组合影响：拓展可用于多种治疗和诊断应用的自组装材料范围。
实施注意事项
- 需要具备固相多肽合成及分析表征（高效液相色谱、基质辅助激光解吸电离、显微镜技术）的专业知识。
- 必须能够使用用于合成、纯化和纳米结构分析的专用仪器设备。
- 测试流程（如凯撒尔试验、氯萘试验）的标准化对实验可重复性至关重要。
- 本方案可适用于多种多肽和聚胺序列，但对于新体系可能需要进行优化。
- 材料纯度和纳米结构的验证是开展后续生物学研究的前提条件。
