福尔马林固定石蜡包埋样本中基因扩增的荧光原位杂交稳健检测
2024年7月12日
本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。
癌基因扩增是癌症发生的关键驱动因素。利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行细胞遗传学表征，是研究癌基因扩增的一种经济有效的方法。本文提供了针对局部基因扩增及FFPE样本检测的可靠且全面的操作指南。
通过分析FISH信号模式，可以明确判断基因座是否扩增以及扩增的方式。以染色体外DNA形式扩增的癌基因在人类癌症中普遍存在，例如肺癌、乳腺癌和脑癌。全基因组测序和FISH是检测染色体外DNA最常用的方法。
将FISH技术应用于FFPE组织具有挑战性，因为交联假象和背景自发荧光常常影响数据质量。本方案包含一系列优化步骤，如蛋白质提取与消化、加热变性以及自发荧光淬灭技术，以提高在FFPE样本上进行FISH实验时的数据质量，从而为患者癌症进展提供有价值的见解。我们将研究染色体外DNA的分子功能以及癌细胞如何维持染色体外DNA。
最终，我们的目标是消除它们以治疗癌症。首先，在老化后获取已制备样本的载玻片。为预处理载玻片，需将其依次浸入盛有适当溶液的考普林瓶中，处理指定时间。
使用 100 至 200 微升蛋白酶 K 消化缓冲液消化组织，在室温下孵育 1 分钟。为终止消化反应，立即将玻片依次浸入乙醇溶液中，每种溶液各 2 分钟。将 FISH 杂交混合液加至玻片上，并用盖玻片覆盖样本。
将载玻片置于热板上，例如在75摄氏度的载玻片杂交系统中加热2至5分钟。然后将载玻片转移至另一设定为37摄氏度的热板上，过夜杂交。接着，将载玻片浸入温热的洗涤缓冲液中，并小心移除盖玻片。
在避光条件下使用适当的试剂清洗并染色载玻片。将载玻片迅速浸入去离子水中，时间不超过一秒，随后置于纸巾上。待其干燥后，用抗荧光淬灭封片剂封片。
将盖玻片盖上，并用指甲油封固，然后进行成像。使用60倍油镜，采集多个Z轴层扫描的荧光信号。最后，进行最大强度三维投影以获得最佳分辨率，并应用去卷积或其他背景清除算法。
在三阴性乳腺癌样本中，细胞核内的FISH信号主要显示每个细胞核有两个不同的点状信号，代表HER2 ERBB-2信号。相比之下，HER2阳性样本则表现出丰富的FISH信号，提示存在不同的基因扩增模式。此外，部分HER2阳性样本的细胞核中可能出现信号簇，提示存在染色体外DNA富集中心，这些中心是基因扩增增强的焦点区域。
概述
本方案提供了一种可重复的方法，用于在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中可视化基因扩增。通过利用FISH技术，研究人员能够有效研究癌基因扩增，这是癌症进展中的一个重要因素。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 遗传学
- 细胞遗传学
背景
- 癌基因扩增是癌症发生的关键驱动因素。
- 福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本常用于细胞遗传学特征分析。
- 荧光原位杂交（FISH）技术对于检测基因扩增至关重要。
- 面临的挑战包括FFPE组织中的交联伪像和自发荧光。
研究目的
- 为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本提供优化的荧光原位杂交（FISH）操作流程。
- 研究癌细胞中染色体外DNA的分子功能。
- 提高数据质量，深化对癌症进展机制的理解。
使用的方法
- FFPE 切片的样品制备与预处理。
- 使用蛋白酶 K 进行蛋白质提取与消化。
- FISH 杂交及成像技术。
- 采用最大 3D 投影与去卷积算法进行数据分析。
主要结果
- 在三阴性乳腺癌样本中观察到不同的FISH信号模式。
- HER2阳性样本显示出丰富的FISH信号，提示基因扩增。
- 在部分细胞核中鉴定出染色体外DNA簇集形成的DNA中心。
- 优化的方法提高了对FFPE组织FISH数据的质量。
结论
- 该方案增强了研究癌症中癌基因扩增的能力。
- 改进的技术有助于更深入理解癌症的发生机制。
- 未来的研究可能会聚焦于清除染色体外DNA以治疗癌症。
常见问题
行业重要性概述
使用FISH技术在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中稳健检测基因扩增，满足了对存档临床标本中癌基因进行可靠评估的关键需求。该能力可提高靶点验证的预测可信度，并在发现阶段和转化研究的关键节点支持基于风险的决策。在FFPE组织中采用标准化的FISH操作流程，能够对基因扩增进行一致性评估，直接影响肿瘤学研发项目组合的优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在临床相关的组织环境中直接可视化基因扩增事件。
- 通过确认肿瘤样本中癌基因的扩增状态，支持功能靶点的验证。
- 通过区分染色体外DNA（ecDNA）驱动的扩增与染色体事件，助力机制层面的风险排除。
- 提高对下游治疗假设验证的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供一种标准化的细胞遗传学检测方法，用于量化福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中的基因扩增。
- 确保在不同组织样本库之间结果的可重复性和可比性。
- 提供适用于检测方法基准建立和平台验证的定量成像输出。
- 支持在肿瘤学研究流程中对候选生物标志物进行可靠筛选。
转化与临床前研究
- 将基因扩增检测与疾病相关的组织模型相结合，实现转化研究的连续性。
- 支持在临床前研究中基于生物标志物进行患者分层。
- 根据已验证的扩增状态，促进对肿瘤学研发资产的风险调整式推进。
- 揭示与癌症进展中染色体外DNA（ecDNA）相关的治疗耐药机制。
流程与工作流整合
该FISH方案通过在FFPE样本中实现可靠的基因扩增评估，融入了从发现到转化研究的连续过程，连接了早期发现、检测开发和转化研究的工作流程。
- 发现生物学：通过检测存档组织中的癌基因扩增，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：提供可重复、定量的荧光原位杂交（FISH）读数，用于检测方法标准化和化合物评估。
- 分析：提供高分辨率成像和定量信号分析，支持比较研究。
- 转化研究：利用临床相关样本，确保生物标志物验证从发现阶段到临床前模型的一致性。
- 企业级复用：建立可重复使用、标准化的基因扩增检测工作流程，适用于各项肿瘤学研究项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中进行基因扩增检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现可靠的生物标志物评估，优化“推进/终止”决策过程并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于经过验证的扩增数据，支持对肿瘤学研发资产进行风险调整后的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备细胞遗传学和荧光成像方面的专业知识，以实现最佳的数据采集。
- 需要使用高质量的成像平台和分析软件进行信号定量。
- 需要跨团队对样本制备和成像方案进行标准化。
- 根据样本特性，可能需要针对不同组织类型或癌基因靶点进行方法调整。
- 潜在的局限性包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本固有的自发荧光和交联伪影。
