优化的宽叶香蒲（Typha latifolia）培养与微生物生物强化方法

本研究解决了目前尚无从种子培育香蒲的规范实验方案这一问题。我们建立了可重复的种子萌发、早期生长及微生物接种增强的方法，以支持未来的植物-微生物相关研究。尽管香蒲在湿地修复研究中被广泛使用，但目前极少有研究从种子开始培育香蒲并追踪其至成熟阶段。

大多数香蒲研究涉及购买根茎用于在实验室研究中繁殖香蒲。很少有研究从种子开始培育香蒲，因此尚无标准化的方法。实现稳定的萌发以及引入微生物的持续定殖一直是一个主要挑战。

我们已开发出可重复的种子萌发和微生物生物强化方法，展示了早期接种如何有助于支持长期定植。首先，使用园艺剪刀从香蒲（Typha latifolia）植株花序基部约两厘米处剪断茎秆。将种子从花序上取下，转移至实验室搅拌器中，直至搅拌器内种子体积约为其容量的1/4，相当于约250毫升未压实的种子。

现在将500毫升自来水加入搅拌机中，确保保留10厘米的顶空空间。以中低速度搅拌混合物20秒，立即将黏稠的混合物转移至一个1升的烧杯中。将约100毫升的种子水混合物倒回搅拌机中。

然后加入 400 至 600 毫升新鲜的自来水，在中高速下搅拌 20 秒。将混合物倒入一个干净的 1 升烧杯中。接着加自来水至烧杯液面达到 800 毫升。

静置60秒后，将顶部漂浮的浮渣轻轻捞出，注意不要扰动底部已沉降的种子。缓慢倒出剩余的水，并将种子转移至一个100毫升的烧杯中。对剩余的种子与水混合物重复进行研磨处理。接下来，将盛有分离后种子的烧杯置于搅拌器上。

搅拌后，用勺子将烧杯液面上漂浮的植物材料捞出。将种子倒入装有滤纸并连接真空泵的布氏漏斗中，静置过夜使其干燥。将干燥后的种子于20 °C保存在50 mL锥形聚丙烯管中。

制备含1%植物琼脂的半倍浓度Murashige和Skoog培养基平板。将约1毫克干燥种子转移至15毫升圆锥形聚丙烯管中，然后向管中加入10毫升无菌双蒸水。

将试管置于中高速振荡摇床上振荡10分钟。随后从试管中移除水溶液，并加入5毫升用无菌双蒸水配制的0.1%吐温20溶液。再次将试管置于中高速振荡摇床上振荡10分钟。

移除吐温20溶液。后续所有步骤均需在火焰或层流罩前进行。用五毫升在无菌双蒸水中配制的30%商用次氯酸钠溶液和0.025%吐温20溶液替换原有溶液。

将上清液替换为无菌的双蒸水，然后在中高速下振荡试管5分钟。第三次洗涤后，将试管在低速下旋转24小时以诱导萌发。

第二天，去除多余的水分，确保管中剩余三毫升液体。现在，在无菌条件下，剪去一个1000微升塑料移液枪头的尖端。使用剪过的枪头在枪头内剧烈吹打，使种子充分悬浮。

将种子和液体接种到一半浓度的Murashige和Skoog琼脂平板上。轻轻旋转平板，使种子均匀分布。用实验室封口膜包裹平板，然后置于培养室中，于23°C、70%湿度条件下进行培养，光照周期为16小时光照、8小时黑暗。

为接种香蒲种子，使用聚山梨酯20漂白剂和重蒸水对种子进行表面消毒，操作如图所示。测定Luteimonas菌株过夜培养物在600纳米处的光密度。用培养基稀释培养物，使其吸光度值标准化至1.0。

现在将1毫升培养物在9,300 ×g条件下离心2分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。再次离心并弃去上清液后，将细菌沉淀重悬于1毫升无菌双蒸水中。

使用灭菌的种子，然后在同一试管中用含0.025%有机硅表面活性剂的溶液将接种物稀释至1:10。在种子萌发前，将悬浮液低速振荡24小时。首先，将选定的土壤用自来水预先润湿，然后装入无菌植物生长培养室单元中。

用铝箔覆盖鲁尔锁扣尖端，并在液体循环条件下对装置进行20分钟高压灭菌。接着，在无菌条件下，将一个0.2微米滤器装置连接到生长室的鲁尔锁扣接头上。打开培养室，向土壤中加入500微升经滤膜灭菌的1% 20-20-20肥料。

使用无菌刮铲搅拌土壤，同时加入无菌的双蒸水，以保持土壤湿润但不饱和。接着，使用无菌剃刀将含有弱小老苗的培养皿中的MS（Murashige和Skoog）琼脂切成四等份。用无菌刮铲将其中一份带幼苗的琼脂转移至生长室中已准备好的土壤上。

将生长室组件转移至植物培养箱中，设置为23摄氏度、70%湿度，光照16小时、黑暗8小时的培养周期。香蒲种子经完全划痕处理后，种子各部分明显分离；而未完全划痕处理的种子其喙部仍附着，未经划痕处理的种子则保持完整。无菌水培系统已被证实可支持香蒲和灯心草属物种的生长，图中所示为灯心草属植物，其在无菌系统中已维持培养长达一年。

采用30%次氯酸钠和聚山梨酯20方法处理时，种子萌发率最高，达到20.8%，显著高于其他所有消毒处理组，但1小时氯气处理组除外，后者未能实现种子的完全灭菌。在划痕处理后的第7天，在非无菌培养皿环境中，萌发的香蒲（Typha）幼苗已发育出可见的根尖和茎组织。移栽至土壤后，部分香蒲幼苗成功定植，并在1至2周内产生新的茎组织。

接种携带 DsRed 质粒的黄单胞菌属（Luteimonas species）后，在接种后第16天，可在香蒲幼苗根部观察到红色荧光细菌的定殖。