实验筛选方案、免疫细胞化学及基于显微镜的成像技术在Penium margaritaceum中的应用

我们的研究聚焦于细胞壁在维持细胞形态和响应外界胁迫中的作用。我们采用多种光学显微镜和共聚焦激光扫描显微镜技术对活细胞中的细胞壁结构进行成像，并利用电子显微镜对细胞壁进行高分辨率成像。

目前尚缺乏表达特定亚细胞蛋白以突出显示细胞壁动态的轮藻门藻类转化细胞系，因此需要使用抗体和其他荧光探针进行研究。Penium 的细胞壁对多种非生物和生物胁迫具有响应性，从而导致表型可塑性。我们发现，细胞壁果胶在此过程中起着重要作用。Penium 的单细胞表型及其可进行活细胞标记的特性，为植物生物学家深入研究细胞壁的结构与发育提供了机会。

[指导教师] 首先，取出5毫升处于活跃生长期的Penium margaritaceum液体细胞培养物，转移至15毫升塑料离心管中，随后进行离心。倒去上清液后，用5毫升新鲜WHM重悬沉淀。将管盖拧紧，剧烈振荡试管10秒，以充分重悬沉淀并去除细胞壁表面的胞外多糖物质。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于1毫升新鲜WHM中，然后将200微升细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中。将微量离心管在微量离心机中以1000 × g离心1分钟，吸除上清液后，用400微升新鲜WHM重悬沉淀。接着，向细胞悬液中加入20微升稀释的单克隆抗体，充分涡旋混匀。然后用铝箔纸包裹试管，在实验室旋转仪上避光孵育90分钟。离心后吸除上清液，用500微升新鲜WHM重悬沉淀，再涡旋10秒。最后一次离心后，将沉淀重悬于400微升WHM中，并加入8微升羊抗大鼠TRITC或FITC荧光二抗。最后，将沉淀重悬于100微升生长培养基中，盖紧管盖并用铝箔纸包裹，直至准备成像。用WHM将JIM5抗体标记的细胞稀释十倍。取50微升稀释后的细胞悬液滴加至盖玻片上。在避光条件下孵育2分钟，使细胞贴附，然后小心地逐滴加入1毫升WHM，冲洗未贴附的细胞。在已贴附的细胞上加入30微升WHM，再覆盖30微升温热的4%琼脂糖（溶于WHM），使其凝固。对于培养在培养皿中的样品，加入足量WHM完全覆盖嵌入琼脂糖的细胞。对于盖玻片上的细胞，将盖玻片翻转，轻轻放置于盛有WHM的凹面载玻片上。将制备好的样品置于荧光显微镜下观察。设置外部光源或使用显微镜内置照明系统，以支持细胞生长和运动。使用TRITC滤光片，每隔10至30分钟拍摄图像，以追踪细胞壁的扩展过程。准备一支含有5毫升经洗涤的10至14天龄细胞培养物的离心管。接着，在1.5毫升微量离心管中加入约100微升0.75微米荧光微球。向管中加入1毫升WHM，剧烈振荡以重悬微球。在10,000 × g下离心3分钟。将最终沉淀重悬于500微升WHM中。随后，向12孔板的每孔加入1毫升WHM培养基。加入抑制剂或生长调节剂至目标浓度，并轻轻摇动培养板混匀。向每孔加入10微升微球溶液，再次轻轻摇动混匀，然后加入10微升经洗涤的细胞悬液，混匀。将培养板置于光照条件下孵育24小时。不扰动培养板，直接将其置于配备FITC滤光片的倒置荧光显微镜下观察。吸取1毫升细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中，在4,000 × g下离心1分钟。弃去上清液后，将含有沉淀的离心管迅速浸入液氮中，或于-80°C冷冻保存。将解冻后的沉淀用20微升WHM重悬。取一滴浓细胞悬液滴加至尺寸为45 × 50毫米的盖玻片上，再将另一张盖玻片覆盖其上形成夹心结构。持续按压夹心结构30秒以破裂细胞。小心分离两张盖玻片，加入WHM冲洗破裂的细胞至15毫升离心管中并进行离心。弃去上清液后，观察白色或微绿色的沉淀。将含有细胞壁的沉淀用去离子水重悬。细胞破裂并离心后，将沉淀用100微升去离子水重悬，再转移至1.5毫升离心管中。接着，将碳导电胶带固定于剑桥样品台表面。用移液器将5微升重悬的细胞壁悬液滴加至碳胶带上。待其过夜干燥后，使用钯靶溅射镀膜50秒。在5千伏电压下，将样品台置于距二次电子探测器10厘米处，选择合适的光斑尺寸进行观察。利用抗果胶单克隆抗体对P. margaritaceum细胞壁进行标记，结果显示形成不规则晶格结构的钙结合纤维网络。果胶沉积于细胞中部或峡部区域，并将较老的果胶推向两极。JIM7标记显示，高甲基酯化果胶最初在峡部以狭窄条带形式分泌。细胞壁中的其他多糖成分，如阿拉伯半乳聚糖蛋白，可通过单克隆抗体JIM13检测到。细胞壁外分泌大量胞外多糖物质，支持细胞滑行和聚集行为。标记技术实现了细胞壁的定量分析和扩展研究，整合了发育成像方法。相关结构研究表明，典型的果胶晶格由纤维网构成，其外部末端具有明显的突起结构。高浓度钙处理可使果胶晶格转变为不规则沉积物，这在JIM5标记的细胞中可观察到。通过扫描电子显微镜观察钙处理后的细胞壁，可清晰看到果胶结构的紊乱状态。