酵母表面展示蛋白的酶法修饰及流式细胞术分析

本研究聚焦于蛋白质化学修饰，这些修饰决定了细胞的行为方式。在此案例中，目标是理解酶对多种底物进行修饰的偏好性及其动力学特征。

首次证明了能够去磷酸化展示在酵母表面的底物分子。这一发现为以往难以实现的酶促修饰的通用性动力学图谱绘制开辟了可能性。本研究解决了与理解酶-底物相互作用相关的挑战。通常，此类评估需要使用细胞裂解物或定制的多肽。本文通过使用酵母展示的底物，提供了一种FasL的替代方案。

本方案将传统的酵母表面展示技术推进到对外部空间中通常为细胞内酶促反应的分析，从而实现对这些通常难以评估的相互作用进行FasL分析。

本方案通过高通量方法实现对多种酶底物特异性的探究，并可通过简单的检测手段进行动力学研究。

[讲师] 首先，将一份预处理的酵母细胞在冰上解冻。直接向细胞中加入0.5至1.5微克含有酵母展示构建体的质粒DNA。然后加入0.5毫升转化溶液，或无菌的50%聚乙二醇和0.1摩尔醋酸锂溶液。使用移液器充分混匀细胞、质粒DNA和转化溶液的混合物。将转化混合物在30摄氏度下静置孵育30至60分钟，并每隔15分钟涡旋振荡一次。在1000G条件下离心收集细胞。准备一个14毫升的培养管，加入4.5毫升含质粒的酵母细胞生长培养基（SDCAA培养基）。将含有目标质粒的细胞重悬于500微升SDCAA培养基中，并接种至已准备好的4.5毫升培养基中。小心地将5毫升接种培养物中的50微升均匀涂布于SDCAA平板上，注意不要刺穿琼脂。在30摄氏度下静置孵育48小时，以测定转化效率。接下来，将5毫升SDCAA细胞培养物置于30摄氏度、300转/分钟的摇床中孵育至少18小时。在培养16小时后检测600纳米处的光密度，并在20小时后重复检测。当样品光密度达到不超过6时，在2500G条件下离心3分钟，弃去上清液，注意不要扰动酵母沉淀。将酵母沉淀重悬于诱导蛋白表达的SRGCAA培养基中，使最终在600纳米处的光密度低于1。将酵母培养物在30摄氏度、300转/分钟的摇床中孵育至少8小时，但不超过24小时。然后测定600纳米处的光密度以确定细胞密度。通过将2倍工作缓冲液与去离子水按1:2比例稀释，在1.7毫升离心管中配制样品的工作缓冲液。根据所需回收两百万酵母细胞的量，将相应体积的酵母培养物加入每个样品的1.7毫升离心管中。在4500G条件下离心1分钟，使用微量移液器小心吸除并弃去上清液，作为生物危害废物处理。将沉淀的细胞重悬于1毫升PBSA中，重复一次离心和上清液去除步骤。暂置一旁。在20微升总反应体积中配制终浓度为1,000纳摩尔的重组人SHP-2溶液。接下来，在15毫升锥形管中将7.7毫克DTT加入10毫升去离子水中，配制成5毫摩尔DTT溶液。取出沉淀的细胞，将其重悬于工作缓冲液中，使每个样品的终反应体积为20微升。向每个样品中加入2微升5毫摩尔DTT溶液，使DTT终浓度为0.5毫摩尔。向每个样品中加入已配制的SHP-2溶液，使终体积达到20微升，并用微量移液器轻轻混匀。用Parafilm封住样品管盖，防止泄漏或交叉污染。将样品在37摄氏度下于旋转仪上以恒定速度孵育2小时。从旋转仪取出样品后，向每个样品中加入1毫升PBSA以终止反应，随后再次离心1分钟，然后弃去上清液。将沉淀的样品重悬于20微升对应的一抗试剂混合液中，在室温下孵育20分钟。20分钟后，在4500G条件下离心1分钟并弃去上清液，作为生物危害废物处理。通过将细胞重悬于1毫升PBSA中清洗一次，然后再次离心。现在，将样品重悬于20微升对应的二抗试剂混合液中，在避光条件下孵育15分钟。离心并弃去上清液后，用PBSA再次清洗细胞一次，然后再次离心。接下来，将清洗后的样品重悬于300至500微升PBSA中，并转移至5毫升聚苯乙烯管中用于流式细胞术分析。在准备流式细胞仪后，点击“文件”，然后点击“新建实验”按钮，命名实验并点击“保存”，以确保所获取的数据保存至指定路径。在上方工具栏中选择点图图标，为每个样品创建两个或更多点图。对于其中一个点图，确保横轴名称显示FSCA通道，纵轴名称显示SSCA通道。对于另一个点图，选择横轴名称显示针对一抗表位标签抗体的二抗试剂所对应的荧光通道，纵轴名称显示链霉亲和素二抗试剂所对应的荧光通道。通过右键点击样品管，选择“编辑名称”并输入样品名称，为样品提供描述性名称。将每个样品管放入细胞仪的样品架中，点击“运行”以开始加载样品并获取数据。根据需要调整事件数、时间和流速。在SSCA对FSCA的点图中，定义一个围绕健康酵母细胞的门控区域。然后记录所有对照样品的荧光信号。在分析处理样品前，为所创建的点图定义门控策略。使用流式细胞仪和门控策略记录去磷酸化样品的荧光信号，然后使用流式细胞术软件进行数据分析。通过测量并比较各组样品和对照中表面表达蛋白的细胞纵轴中位荧光值与非表达细胞提供的基础磷酸化水平，评估磷酸化程度。最后，使用提供的公式计算中位磷酸化水平的百分比差异。本图展示了不同SHP-2磷酸酶浓度和孵育时间对酵母表面展示底物中中位磷酸化差异的影响。在所有SHP-2浓度下，中位磷酸化差异随时间延长而降低，在1,000纳摩尔SHP-2浓度下孵育4小时时观察到最高的去磷酸化水平。孵育2小时后，1,000纳摩尔SHP-2导致中位磷酸化差异约为48.8%，显著低于相同时间点750纳摩尔条件下的结果。当孵育时间从2小时延长至3小时时，在500纳摩尔、750纳摩尔和1,000纳摩尔SHP-2浓度下，中位磷酸化差异均未观察到显著变化。