高盐饮食条件下盐敏感大鼠肠道微生物胞外囊泡的分离与差异表征

本研究探讨了高盐饮食下盐敏感性高血压大鼠肠道微生物胞外囊泡的作用，分析高盐饮食如何改变这些囊泡，并影响高血压及免疫相互作用。该领域的最新进展包括：明确肠道微生物胞外囊泡在高血压中的作用，评估高盐饮食对微生物多样性的影​​响，以及实施以代谢和免疫调节为目标的植物性干预措施。当前实验面临的挑战主要包括：高效分离高纯度的胞外囊泡，区分宿主来源的囊泡与微生物组来源的囊泡，以及在标准染色方案中尽量减少样品损失，以确保不同研究之间的可重复性。本研究所采用的密度梯度离心方案相较于传统方法，能更优先富集完整性更高、可重复性更佳的胞外囊泡，从而为高血压相关肠道微生物组胞外囊泡的研究提供更可靠的技术支持。

[旁白] 首先，将五克粪便转移至已预称重的50毫升离心管中。向管中加入50毫升预热至37摄氏度的无内毒素PBS缓冲液，并旋转混匀30分钟。将高速离心机预冷至4摄氏度。随后将样品对称放入离心机中，在8,000G条件下离心15分钟。离心结束后，吸除上清液，并将其转移至新的无菌离心管中。再次离心15分钟后，小心吸除上清液，用于后续分析。将无菌的0.22微米滤器装置置于冰上。将上清液转移至滤器顶部，开启真空泵以收集滤过样品。将滤液转移至截留分子量为10千道尔顿、容量为15毫升的离心过滤装置中。在4摄氏度、3,000G条件下离心30分钟，将样品浓缩至至少1,400微升。立即置于冰上保存。取一份体积的梯度缓冲液A与五份体积的密度梯度介质混合，配制工作液。通过将一份工作液与四份缓冲液B混合，配制10%碘克沙醇溶液；同理，将两份工作液与三份缓冲液B混合配制20%碘克沙醇溶液，将四份工作液与一份缓冲液B混合配制40%碘克沙醇溶液。现在将先前浓缩的样品与七毫升密度梯度介质混合，制成50%碘克沙醇溶液。为制备密度梯度，向40%和10%碘克沙醇溶液中加入台盼蓝溶液。将八毫升50%碘克沙醇溶液转移至薄壁聚丙烯离心管底部。将离心管倾斜至70度角，沿液面缓慢加入八毫升40%碘克沙醇溶液。随后依次加入八毫升20%碘克沙醇溶液、七毫升10%碘克沙醇溶液以及两毫升无内毒素PBS缓冲液。将已制备好的密度梯度管放入预冷的超速离心机中。设置超速离心参数为100,000G、20小时、10摄氏度，开始离心运行。在进行人工密度梯度分离收集时，密度梯度总体积约为34毫升。从液体表面中心缓慢吸取2毫升溶液，每2毫升为一个梯度组分，因此密度梯度溶液共分为17个梯度组分。最后，使用移液器将各密度组分转移至无菌样品管中，并立即置于冰上。纳米颗粒追踪分析显示，从不同密度梯度组分中收集的细胞外囊泡在大小、分布及浓度方面具有特征性谱型。所有组分中，大多数细胞外囊泡集中在30至100纳米的粒径范围内，符合典型的分布模式。细胞外囊泡浓度在第九组分中达到最高，峰值约为每毫升3.85×10⁹个颗粒。采用二辛可宁酸试剂盒测定的蛋白含量也在第九组分中最高，达0.417微克/微升。此外，利用内毒素检测试剂盒检测发现，第九和第十组分中的脂多糖表达水平显著升高。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析中，第九组分也显示出更高的蛋白含量。透射电子显微镜（TEM）图像显示，细胞外囊泡具有圆形膜样形态。