以最少样本量绘制婴儿免疫图谱：整合性单细胞与多组学分析
2026年4月3日
本方案描述了从新生儿和儿科患者中采集和保存血液样本的方法，并应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、蛋白质组学和光谱流式细胞术对这些样本中的免疫细胞群体进行表征。
我们的研究通过从小量血液样本中进行纵向高维多组学分析，定义了生命早期免疫系统在出生后的适应机制。该方案可应用于新生儿和儿科研究，对健康、感染及炎症状态下有限生物样本的纵向免疫谱进行分析。首先，将含有裂解婴儿红细胞的小瓶在37°C水浴中快速解冻。
将解冻的细胞转移至含有10毫升37摄氏度预热的完全RPMI培养基的15毫升锥形管中。在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。用3毫升完全RPMI培养基重悬细胞沉淀，并计数细胞总数。
如果样本浓度过高无法计数，则需进行稀释。计数细胞后，重复离心步骤，并将细胞重新悬浮于完全RPMI培养基中，调整浓度至每毫升含一百万个细胞。将含有十万个细胞的100微升悬液转移至96孔V型底板的每个孔中。
将培养板在4°C、764 ×g条件下离心2分钟。弃去上清液。接下来，除未染色对照外，向所有样品中加入100 µL活/死染料原液（用含FC阻断剂和单核细胞阻断剂的PBS按1:2,000稀释），其中FC阻断剂和单核细胞阻断剂均按1:100稀释。
将样品在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。洗涤细胞时，加入 100 µL PBS。在 4 摄氏度下以 764 ×g 离心 2 分钟，小心弃去上清液。
除未染色对照外，向所有样本中加入100微升表面抗体混合液，该混合液用荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液按1:200比例稀释。在4摄氏度下孵育30分钟。然后用100微升FACS缓冲液洗涤细胞，离心并弃去上清液。
向每个样本中加入100 µL 4%多聚甲醛固定细胞，在室温避光条件下孵育15分钟，然后再次洗涤细胞，并重悬于200 µL FACS缓冲液中。制备UltraComp补偿微珠作为单色对照。
使用与样本相同的步骤对单色对照微球进行染色，如果样本经过固定，则也需对微球进行固定。同样地，制备荧光减一（fluorescence minus one，FMO）对照。在常规或光谱流式细胞仪上检测样本、单色对照、未染色对照以及荧光减一对照。
打开 FlowJo 软件，选择需要分析的样本。使用相应的同型对照和荧光减一对照（FMO）设置门控。通过 FSC 与 SSC 点图对白细胞设门，以排除碎片，并根据细胞大小和颗粒度选择目标细胞。
使用FSC-A与FSC-H排除双联体。利用活细胞染料设门以排除死细胞。从活的单细胞中，分为CD33阴性淋巴细胞和CD33阳性髓系细胞。
在 CD33 阳性细胞中，鉴定 CD14 阳性单核细胞。随后在 CD33 阳性细胞中，鉴定 CD14 阴性、CD11C 阳性树突状细胞。接着，在 CD33 阴性淋巴细胞中，鉴定 CD3 阳性 T 细胞以及 CD3 阴性、CD56 阳性自然杀伤细胞。
在CD3阳性T细胞中，鉴定CD8阳性与CD4阳性亚群，并鉴定CD3阴性、CD56阴性、CD19阳性B细胞。首先，将一管冻存的红细胞裂解后的细胞置于37°C水浴中解冻。将细胞悬液转移至含有10 mL T细胞培养基的15 mL圆锥形离心管中，在4°C条件下以430 ×g离心5分钟。
弃去上清液。用一毫升磷酸盐缓冲液重悬细胞沉淀后，向样品中再加入九毫升磷酸盐缓冲液。在4 °C条件下以430 ×g离心五分钟，弃去上清液。
使用台盼蓝染色排除法计数细胞并评估细胞活力。如果细胞活力低于70%，则按照以下步骤使用死细胞去除试剂盒。首先，通过将20倍浓度的结合缓冲液储存液用无菌双蒸水稀释，制备1倍浓度的结合缓冲液。
每 10^7 个总细胞，用 100 微升去死细胞去除微珠重悬细胞沉淀。充分混匀后，在室温下孵育 15 分钟。将磁性分离柱放入合适的磁力架中，并配以收集管。
然后用500微升1×结合缓冲液冲洗柱子以平衡。用1×结合缓冲液将细胞悬液体积调至500微升。更换收集管后，将细胞悬液加入柱中，并用新的1.7毫升微量离心管收集穿流液。
接下来，用 500 微升结合缓冲液将柱子洗涤两次，每次的流穿液均收集至同一微量离心管中。将洗脱液在 300 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液。使用台盼蓝排斥法再次对细胞进行计数并评估其活力。
取20,000个活细胞分装至新的1.7毫升微量离心管中。随后以300 g离心10分钟，并弃去上清液。用40微升含0.04% BSA的PBS重悬细胞。
最后，将含有细胞的离心管置于冰上，并立即送至基因组核心实验室进行文库构建和测序。以细胞捕获器（cell ranger）输出格式收集测序结果。对早产儿和对照组的干血斑样本进行了处理。
同时对92种免疫相关蛋白的标准化蛋白表达水平进行了定量分析。与足月脐带血相比，早产儿在两个月龄时外周血中淋巴细胞活化基因3和信号阈值调节跨膜衔接蛋白1的表达水平显著升高。采用全面的设门策略，从红细胞裂解后的白细胞样本中鉴定白细胞群体。
在T细胞群体中，区分出CD4阳性与CD8阳性亚群。经过筛选后，在单细胞核糖核酸测序数据集中捕获并分析了超过120,000个细胞。通过降维及聚类分析，鉴定了14个不同的细胞簇。
根据差异表达基因和已知的细胞标志物对细胞簇进行注释。14个细胞簇中的12个对应于免疫细胞谱系，包括T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、髓系细胞和中性粒细胞。堆叠柱状图展示了在出生后一周、一个月和两个月时各细胞簇中细胞的相对比例。
本研究能够从有限体积的血液样本中纵向测量细胞、转录组、蛋白质组及功能性的免疫特征。未来的研究可利用这些方法定义健康的免疫轨迹，并揭示与疾病相关的生命早期免疫应答失调现象。
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概述
本文介绍了利用极小血量对新生儿进行高维免疫谱型分析的优化方案。通过整合流式细胞术、蛋白质组学和单细胞RNA测序等先进技术，该研究能够对新生儿免疫系统的发育进行全面的纵向分析，即使是对极低出生体重或早产婴儿也同样适用。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 新生儿与儿科研究
- 单细胞分析
背景
- 新生儿免疫系统在出生后会迅速适应新的、富含刺激物的环境。
- 生命早期的免疫反应是针对发育需求特异性调节的，而不仅仅是未成熟的表现。
- 由于可用于研究的血液量有限，新生儿免疫系统的研究面临挑战。
- 全面的免疫谱型分析需要采用能够从小样本中最大化获取数据的方法。
研究目的
- 开发并示范从微量新生儿血液样本中进行高维免疫谱分析的实验方案。
- 实现对新生儿和早产儿免疫系统发育的纵向研究。
- 随时间推移捕捉细胞、转录组和蛋白质组层面的免疫特征。
使用的方法
- 新生儿裂解红细胞样本的解冻与处理。
- 采用详细设门策略的流式细胞术，用于鉴定免疫细胞亚群（T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞、树突状细胞、单核细胞、中性粒细胞）。
- 干血斑样本的蛋白质组学分析，定量检测92种免疫相关蛋白。
- 单细胞RNA测序，包括死细胞去除、文库构建及对超过120,000个细胞的聚类分析。
- 在多个时间点（一周、一个月、两个月）进行纵向采样。
主要结果
- 该方案能够利用适合新生儿和早产儿的极小血液体积进行免疫谱型分析。
- 与足月脐带血相比，早产儿在两个月时淋巴细胞活化基因3和信号阈值调节跨膜适配蛋白1的表达显著升高。
- 鉴定并注释了14个不同的细胞簇，其中12个对应于已知的免疫细胞谱系。
- 可视化呈现早期生命阶段免疫细胞比例的动态变化。
结论
- 所述方法可利用有限的新生儿血液样本进行全面、纵向的免疫谱型分析。
- 这些方法有助于研究健康免疫系统的发育过程，并识别与疾病相关的失调免疫应答。
- 这些实验方案广泛适用于新生儿及儿科免疫学研究。
常见问题
行业重要性概述
利用极少量新生儿血液样本进行整合性的单细胞与多组学分析，可前所未有地揭示生命早期免疫系统的发育过程，克服儿科研究中关键的样本量限制。该方法支持对免疫发育轨迹进行高分辨率描绘，有助于在人类免疫系统发育的最早阶段开展靶点验证和机制性风险评估。这些实验方案可实现纵向、定量的免疫监测，直接为儿科及新生儿治疗项目的转化研究决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用极少量生物样本即可直接研究新生儿免疫细胞群体及其通路。
- 通过获取发育不同时间点的转录组和蛋白质组特征，支持功能靶点的验证。
- 揭示生命早期独特的免疫适应机制，为儿科免疫学项目提供机制层面的风险评估依据。
- 提高针对新生儿及儿科适应症靶点选择的可预测性与信心。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证且可重复的低样本量免疫细胞鉴定与定量工作流程。
- 标准化流式细胞术的设门策略与对照方案，确保检测的可靠性与可比性。
- 实现免疫表型及蛋白质表达谱的可扩展、高维度筛选。
- 为下游化合物评价和生物标志物发现提供稳健的生物系统准备。
转化与临床前研究
- 将免疫谱型分析结果与疾病相关的儿童及新生儿模型相匹配。
- 支持针对生命早期免疫失调的纵向生物标志物发现与验证。
- 通过实现重复采样和分析，提供从发现到临床前验证的连续性。
- 通过绘制婴儿健康与失调免疫轨迹，降低转化研究的风险。
流程与工作流整合
这种整合分析方法通过利用有限的新生儿样本实现全面的免疫分析，将早期发现、筛选和转化研究连接起来。
- Discovery Biology：促进在生命早期免疫背景下进行假设验证和通路解析。
- Screening：提供定量、可重复的免疫细胞和蛋白质测量结果，适用于高通量工作流程。
- Analytics：提供多组学读数和统计输出，用于对发育状态和疾病状态进行稳健比较。
- Translational Research：支持在儿科和新生儿项目中进行生物标志物匹配及风险调整后的进展评估。
- Enterprise Reuse：为跨多种儿科研究计划的免疫谱分析提供标准化、可扩展的平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高儿科免疫学研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：仅需极少量样本输入，即可实现标准化、可重复且可扩展的免疫谱型分析。
- 战略价值：通过有限样本提供高维度数据，优化决策流程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对儿科及新生儿治疗资产进行基于风险调整的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、单细胞RNA测序和蛋白质组学数据分析的专业知识。
- 需要获得先进的仪器设备和生物信息学基础设施，以支持多组学数据整合。
- 要求各团队在样本处理、设门策略和对照方案方面进行严格统一的标准化。
- 通过优化实验方案，可适用于多种儿科和新生儿模型系统。
- 受限于对测序和蛋白质组学所需的专用试剂及核心设施支持的需求。
