Microarrays DNA: בקרת איכות המדגם, הכלאת מערך סריקה ו

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע ניסוי מיקרו-מערך (microarray) באמצעות מכשיר ערבוב אוטומטי. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ניתוח איכות דגימות ה-RNA באמצעות bioanalyzer לאחר הגברה וסימון של ה-RNA. דגימות ה-RNA עוברות היברידיזציה למיקרו-מערכים.

לבסוף, המערכים המיקרוסקופיים (microarrays) המגובבים נשטפים ונסרקים. בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המראות את הביטוי הדיפרנציאלי של תמלילי RNA באמצעות ניתוח של תמונות מיקרומערכים עם פלואורסצנציה דו-צבעית. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הגיבוב של המיקרומערך קשה ללמוד בשל הציוד המיוחד.

ניתוח בקרת האיכות מתחיל בהכנת מכשיר ה-2, 100 bioanalyzer ותחנת ההכנה של השבב (chip priming station) כפי שהונחו בנוהל הכתוב. לאחר מכן, מסננים את מטריצת הג'ל על ידי העברת 550 microliters באמצעות פיפט למסנן סבוב (spin filter) המסופק עם ערכת ה-RNA 6, 000 nano. מסובבים את המסנן ב-1, 500 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, חלק את הג'ל המסונן לאליקוטות של 65 µL, אותן ניתן לשמור בטמפרטורה של 4 °C למשך עד חודש אחד. ערבב את תרכיז הצבע ב-Vortex למשך 10 שניות והוסף 1 µL לאליקוטה של 65 µL. לאחר ערבוב התערובת של הג'ל המסונן, סבב בצנטריפוגה ב-13,000 RCF למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני הרצת הדגימות.

ראשית, מקמו שבב בתחנת ההכנה (priming station). בהדגמה זו, נעשה שימוש בשבבי RNA 6,000 nano. טענו תשעה מיקרוליטרים (9 µL) של תערובת צבע הג'ל לבאר המסומנת באות G לבנה על רקע שחור.

כאשר קצה הפ pipette ממוקם בתחתית הבאר. כוון את בוכנת המזרק ל-1 mL וסגור את תחנת ההכנה (priming station). לחץ את הבוכנה למטה באיטיות אך בעקביות עד שתיתמך על ידי התפס.

לאחר 30 שניות, שחררו את התפסן והמתינו מספר שניות עד שהבוכנה תעלה. לאחר שהבוכנה נעצרת, משכו אותה חזרה למצב של one milliliter ופתחו את תחנת ההכנה (priming station). טענו nine microliters של צבע הג'ל.

ערבבו בכל אחת משתי הבארות. סמנו את G. לאחר מכן, טפטפו חמישה µL מהמסמן לבאר הסולם ולכל אחת מ-12 בארות הדגימה. בשלב הבא, טענו מיקרוליטר אחד של הסולם הדנטורי לבאר הסולם ומיקרוליטר אחד מכל דגימה דנטורית לבארות הדגימה.

לבסוף, הוסיפו מיקרוליטר אחד של המארקר לכל דגימה שאינה בשימוש. לאחר טעינת הבארים, ערבבו את השבב ב-vortex למשך דקה אחת במהירות של 2,400 RPM. לאחר הפעלת תוכנת ה-2,100 expert, מקמו את השבב וסגרו את המכסה.

וודאו שהפורט הנכון נבחר והריצו את הבדיקה בתוך חמש דקות מהטענת הדגימות כדי למנוע התאיידות. שיטות לביצוע הגברה וסימון של RNA ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. לאחר הסימון, טהרו את ה-CRNA כדי להסיר נוקלאוטידים שלא נקשרו. באמצעות עמודי cogens r an easy mini, ניתן לכמת את ה-CRNA המסומן בעזרת ספקטרופוטומטר NanoDrop 2000.

במצב מדידת מיקרומערך (microarray), רשמו את ריכוז הדגימה, את היבול ואת הפעילות הספציפית. עבור היברידיזציה של מיקרומערך, יש להשיג יבול של לפחות 825 nanograms ופעילות ספציפית של לפחות שמונה picomoles per microgram לפחות שעתיים לפני ההיברידיזציה של המיקרומערך. הדליקו את תחנת ההיברידיזציה והגדירו אותה ל-65 °C.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכי Agilent 4x40 4K עם מערכת ההיברידיזציה Roche NimbleGen ומספר ארבעה של תאי ערבוב. לאחר ביצוע פרגמנטציה של CRNA כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, הכין את תא ההיברידיזציה. הנח שקופית מיקרו-מערך בכלי הפירוק וההרכבה, כאשר צד הברקוד פונה כלפי מטה. ראשית, פתח את מערבל A4 וחשוף את הדבק המחזיק את המערך ואת כלי הפירוק וההרכבה כדי למנוע כל תזוזה.

הניחו את מערבל A four על השקף, החל מהקצה הרחוק. ודאו שהוא מיושר כראוי לכלי והדביקו את המערבל לאורך המערך. משכו את השקף מקצה המערבל כדי להסיר את מכלול השקף והמערבל.

באמצעות כלי הריחוף (braying tool), לחצו לכל אורך אטם הדבק כדי לוודא שהוא מודבק היטב לשקופית. ניתן להבחין בבועות אוויר קטנות שנלכדו בין הדבק לשקופית על רקע כהה. הקדישו זמן נוסף כדי להסיר בועות אלו בעזרת כלי הריחוף.

המערך מוכן כעת להטענה. השתמש בפיפט של דחיקה חיובית (positive displacement pipet) כדי להטעין 100 µL של דגימת ההיברידיזציה. דחף את הקצה בחוזקה לתוך פתח הכניסה ושחרר את הנוזל באיטיות ובאופן חלק כדי למנוע כלואת אוויר באזור המערך.

כאשר הדגימה מכסה את כל המערך ונוזל מתחיל לצאת מפתח הניקוז, הסירו במהירות את הפיפטה אך שחררו רק את הבוכנה. ברגע שהטיפ רחוק מהסלייד, ספגו בעדינות את עודפי הנוזל בשני הפתחים, תוך הקפדה לא לשאוב דגימה מתוך התא עצמו. לאחר מכן, כסו את פתחי הניקוז במדבקות באמצעות פינצטה.

הניחו את השקופית בתחנת ההיברידיזציה וודאו שחורי השלפוחית ממוקמים נכון מעל טבעות האיטום (O rings). פעולה זו תבטיח ערבוב תקין במהלך ההיברידיזציה. סגרו את כיסוי השקופית ואת מכסה התחנה.

הגדירו את התחנה למצב ערבוב B ובצעו היברידיזציה למערך בטמפרטורה של 65 °C למשך 17 שעות. עם סיום התהליך, מלאו את כלי הזכוכית המסומן ב-A בבופר שטיפה 1; על הכלי להיות גדול מספיק כדי להכיל את כלי הפירוק וההרכבה ולאפשר מרחב תמרון. יש לבצע את כל השטיפות בכלי זכוכית, מכיוון שפלסטיק נוטה להפריש תרכובות הגורמות לרקע גבוה במערך.

הניחו מתקן שקופיות ומגנט ערבוב בתוך כלי צביעה. סמנו את הכלי באות B, מלאו אותו ב-wash buffer one עד לכיסוי המתקן, והניחו את הכלי על בוחש מגנטי בטמפרטורת החדר. כמו כן, הוסיפו מגנט ערבוב לכלי צביעה ריק המסומן באות C והניחו אותו על בוחש מגנטי.

הוציאו את המערך מתחנת ההכלאה והניחו אותו בכלי לפירוק והרכבה. טבלו את כל המכלול בתוך צלח תוךما החזקת כלי הפירוק וההרכבה והשקופית מצדדים מנוגדים ביד אחת. קלפו בזהירות את ערבב ה-A four, תוך הקפדה לא לשרוט את אזור המערך.

הניחו במהירות את הפלטה על המעמד ובתוך כלי הצביעה B. יש למזער את החשיפה לאוויר מכיוון שצבע SCI five רגיש לאוזון. שטפו את המחיקה במשך דקה אחת תוך כדי ערבוב במהירות בינונית. מלאו את כלי הצביעה C בבופר שטיפה 2 שחומם מראש.

העבירו את השקופיות ושטפו במשך דקה אחת. לאחר השטיפה, הוציאו את מתקן השקופיות מכלי הצביעה C באיטיות רבה כדי לצמצם את כמות הטיפות שנותרות על השקופית. ייבשו את השקופית באמצעות סבוב (spinning) למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הניחו את העגילה בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter ומלאו בגז ארגון; בצעו סריקה מיידית באמצעות סורק gene picks 4, 000 B מבית molecular devices כדי למנוע את אובדן האות המוצג. להלן דוגמאות לארבעה דגימות RNA שהבודדו ממוח אנושי. איכות דגימת רקמת הגידול הוערכה באמצעות bioanalyzer 2, 100 על גבי RNA 6, 000 chip.

חצי חצים מלאים ופתוחים מציינים את מיקומם של מיני ה-18 s וה-28 S-R-R-N-A, בהתאמה. מספר שלמות ה-RNA או RIN הוא מדידה כמותית של איכות ה-RNA. דגימות Total RNA באיכות טובה אמורות להניב שני שיאים עיקריים בלבד כאשר הן מורצות ב-bioanalyzer לבקרת איכות, אשר תואמים לשני מיני ה-ribosomal RNA העיקריים.

פירוק מסוים של RNA יופיע כפס (smear) לפני שיא ה-RNA הריבוסומלי הראשון, ושיא נמוך משמעותית עבור 28 S-R-R-N-A כאשר הפירוק חמור. RNA באיכות נמוכה יציג שיא רחב או סדרה של שיאים בזמני שהייה (retention times) נמוכים. במצב זה, שני שיאי ה-RNA הריבוסומלי יהיו בעצימות נמוכה מאוד או שלא ניתן יהיה לזהותם כלל.

מערכים באיכות טובה אמורים להניב אות גבוה בערכי PMT נמוכים יחסית. רוב התמלילים צפויים להיות נוכחים ברמות דומות בדגימה הניסויית ובדגימת הייחוס. שינויים נרחבים ומסיביים בביטוי הגנים ככל הנראה יהיו חסרי משמעות ביולוגית.

לפיכך, רוב המערך צריך להיראות צהוב ולא ירוק או אדום. אותות באיכות טובה צריכים להיות גם בטווח דינמי כך שהיסטוגרמות האותות יחפפו באופן מלא, כפי שנראה בתרשים הפיזור של תמונת המערך. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן ביצוע ניסוי מיקרו-מערך (microarray) באמצעות מכשיר היברידיזציה אוטומטי.